免疫学检测方法中的干扰因素及对应措施

发布时间:2019-06-28       作者:张泓       来源:临床实验室        浏览:10091       收藏: 1

免疫学检测方法中的干扰因素及对应措施

文丨上海交通大学附属儿童医院检验科主任 张泓

背景:目前在临床检验诊断中,免疫检测技术日趋完善,从20世纪50年代美国学者Berson和Yallow发明了放射免疫测定技术检测胰岛素起,免疫学检测技术经历了从定性到定量;从常量分析到微量、超微量分析;从手工检测到全自动化;从单个标本检测到高通量检测等一系列发展,在日常检验中各种影响因素也一直是临床实验室所关注的问题。在临床检验诊断中,免疫检测作为主流检测方法具有高特异性,高灵敏性的特点。准确的检测方法以及精确的检测结果一直是做为临床检验所追求的,但无可厚非,日常不免会有检测的影响因素来干扰检测结果,广义上干扰物是导致分析物浓度或者使反应活力出现偏移,早在上个世纪70年代的临床试验研究中,实验检验员已经发现免疫法检测中存在各种的干扰,很多医生尝试着发掘更多干扰因素制定解决方案从而获得更加准确的结果。目前而言,虽然市场上制定了很多较为先进的免疫检测方法,但仍然无法从根本上避免干扰。大量的研究表明,免疫检测干扰因素会导致检测结果出现不同程度假性升高或者降低的情况,从而影响临床医生对病情的诊断和评估,甚至对于药物的使用量有一定误判,伴随着免疫检测技术的发展,各大厂商在免疫检测方法和防干扰模式上都尝试探索,出现了新的进展,取得一定的成果,对临床研究提供了科学的指导和借鉴。目前主要干扰因素分为异嗜性抗体,激素结合蛋白,钩状效应,交叉物质等内源性物质干扰以及检测仪器的在控状态,标本溶血,标本被细菌污染,亦或者标本保存时间过长等外源性干扰因素,下文针对免疫检测干扰因素和控制措施展开论述,从而为临床检验提供一定的参考和借鉴。[1]

1. 免疫检测的内源性干扰:

1.1 嗜异性抗体是干扰的免疫测定中一个公认的原因。嗜异性抗体针对定义不明确的抗原产生,并且通常显示弱亲和力,是多种特异性的。其他干扰抗体可以是特异性人抗动物抗体,其可以针对动物免疫球蛋白(Ig)产生。其干扰机制主要是异嗜性抗体有多个特异性结合位点,能与各种动物制成的生物制剂的抗体结合,标记抗原或者抗体,从而干扰测定,使得检测结果出现假阳性或者假阴性,例如:嗜异性抗体可通过桥接捕获和检测抗体而在双位点免疫测定中引起假阳性结果而发生干扰。同样地,嗜异性抗体可以通过直接结合捕获抗体并因此阻止反应位点结合目标分析物而导致假阴性结果。其假性升高主要见于HIV,AFP,CA125,PCT等检测,假性降低见于皮质醇,甲状腺球蛋白等检测,目前对于自身免疫性疾病,以及近期输血或者与动物接触的检测者常见其干扰,临床常见的鉴别方法也有很多,最常见的如用阻滞剂处理,结果与原来的差距较大的时候可考虑异嗜性抗体。也可用其方法消除干扰。


1.2 钩状效应 免疫反应具有比例性,由于抗原抗体不等价性,使抗原抗体反应时存在对应比例关系,生成物的量与反应物的量(浓度)有关。只有比例合适,结合价相互饱和,才生成可见的复合物,在等价带前后分别为抗体、抗原过剩则影响沉淀物的形成,这种现象称为带现象。带现象在临床检验中经常出现,特别是ELISA与凝集反应中。出现在抗体过量时,称为前带,出现在抗原过剩时,称为后带。在平时临床检测工作中需要注意前带和后带现象,以免出现假阴性结果,目前各大厂商的试剂盒也会在试剂盒说明书明确标明产生钩状效应值避免检测干扰。


1.3 自身免疫病抗体和补体 自身抗体主要是在自身免疫失控下产生的特异性蛋白,如抗甲状腺球蛋白产生可干扰甲状腺球蛋白的检测,抗胰蛋白嗜靶抗原的自身抗体能与对应的靶位抗原形成复合物,对检测会产生负相关影响,判断是否是自身抗体对于检测的干扰应答,可以通过结合检测病人的病史进行判断,尤其为甲亢,I型糖尿病,甲减尤为注意。补体作为血清蛋白,存在于人和脊椎动物血清及组织液中,可介导体内免疫应答和炎症反应,在免疫检测系统中捕获抗体在向标记抗体的标记过程中,抗体分子会发生变构,其Fc段的补体C1q分子结合位点也同时被暴露出来,使C1q可以将二者连接起来,从而造成假阳性,对于其干扰的影响,可以通过EDTA及加热的方式灭活补体来去除。


1.4 交叉物质 交叉反应物质是指类地高辛,类AFP物质,与交叉的靶抗原有交叉反应物质,也有人工合成的摄入物质如新活素药物(人工合成的脑利钠钛)对于BNP的检测具有交叉反应从而干扰检测。

2. 免疫检测的外源性干扰

2.1 溶血 在标本收集过程中,由于压脉带过紧,抗凝血混匀用力过度,离心破管等造成标本溶血,溶血时释放大量过氧化物酶活性的血红蛋白,一方面标本溶血,其细胞碎片以及蛋白质会对定性检测,尤其肉眼判读的有一定误差,另一方面其血红蛋白具有过氧化物酶活性,在如以辣根过氧化物酶标记的显色反应中,会导致非特异性显色,根据检测的方法不同导致的结果为正负干扰,在标本检测前对于标本的筛选显得尤为重要。


2.2 脂血:在大多数实验室中,对于血脂中的CM和VLDL悬浮颗粒,使标本产生浑浊,凝集现象,同时对于检测中使用比浊法的项目造成较大干扰,其干扰机制主要有肉眼对于结果的判断以及自动化仪器中影响光散射,增加标本内物质的极性和非极性[2]。降低甚至消除脂血带来的干扰对避免发出与临床不符的检测报告给临床医师造成误诊有重要意义。检测前应用自动化系统筛选脂血标本,建立检验分析前适合自动化系统筛选样品的管理标准。将筛选出来的脂血标本进行预处理,其处理方法主要有,真空超速离心(90,000r/min,15min)、高速离心(≥13,000r/min,15 min)、脂质清除剂、萃取、PEG分离等方法,可根据实验室自身情况进行处理。[3,4]


2.3 纤维蛋白:一般情况下,血液标本如果没有在抗凝剂及促凝剂的情况下,0.5小时开始凝固,约2小时会完全凝固,有时为了争取TAT时间,获得更快的检测结果,在未开始凝固时或者未完全凝固时,就强行离心分离血清。此状态下,标本内仍含有残留的部分纤维蛋白,形成肉眼可见的纤维蛋白块,引起假阳性判断。一项研究调查发现3962份血标本中cTnI检测(用Abbott AxSYM分析),有307份标本升高,再将307份标本重新离心,有24份标本检测结果明显下降,其中20份低于正常cutoff值[5]。对于目前解决方法主要是标本检测时需充分凝固再分离血清,或者加入适当促凝剂。


2.4 标本污染及保存时间:检测标本若被细菌污染,细菌体内可能含有内源性的过氧化氢酶从而产生非特异性显色干扰检查结果。对于存放时间过久的标本和试剂,在冰箱中保存过久的标本,血清中IgG可聚合成多聚体、AFP可形成二聚体,在间接法ELISA测定中会导致本底过深、甚至造成假阳性;标本放置时间过长(如一天以上),有时抗原或抗体免疫活性减弱,亦可出现假阴性。为克服上述干扰,ELISA测定的血清标本宜为新鲜采集;如不能立即测定,5天内测定的血清标本可存放于4℃,1周后测定的血清标本应低温冻存;冻存后融解的标本,蛋白质局部浓缩,分布不均,应充分混合后再测定,但混匀时应轻柔,不可强烈振荡。


2.5 生物素:生物素(Biotin)属于B族维生素,临床称为维生素B7,也被称为维生素H或辅酶R[6]。生物素对于生命活动至关重要,其可参与脂肪代谢以及二氧化碳的转运以及糖异生等生命活动,后续市场上陆续推出各类保健品改善于发质皮肤,以及作为复合B族维生素补充剂和预防妊娠期间生物素的缺乏,以及多发性硬化症,先天性代谢紊乱,线粒体能量障碍等适应症。生物素-链酶亲和素系统Biotin- Based ImmunoAssay,BBA,它是近代发展起来的一种生物反应放大系统;主要以生物素和链霉亲和素具有的独特结合特性为基础,可偶联抗原抗体等大分子生物活性物质;结合迅速、专一、稳定,并具有多级放大效应,自然界中已知的最强的非共价生物相互作用;后续被大规模使用在诊断应用中,其生物素分子有两个环状,I环为咪唑酮环和II环噻吩环,咪唑酮环是与亲和素结合的主要部位,链酶亲和素是由链霉菌产生的一种蛋白质,链酶亲和素分子量65Kd,有四个相同的肽链组成,每条肽链都能与一个生物素分子形成强度极高的非共价,起到联级放大的作用。后续这一技术被广泛用于免疫检测,关于生物素干扰[7],其主要机制为:(1)三明治法检测干扰:链酶亲和素结合于固相底物上,样本中的待测物质与溶液中的生物素标记抗体结合,并形成信号,主要用于大分子检测,如HBsAg,HCG.等,信号的强弱与检测的浓度呈正比,但有文献指出如果血清或血浆标本中有极高剂量的游离生物素会在检测时与原本溶液中有的生物素化的标记抗体竞争性结合链霉素,从而导致检测结果实际检测浓度低;(2)竞争法检测干扰,竞争法主要是指生物素法的标记抗原与未标记的生物素化抗原竞争结合链霉素从而形成检测信号,其信号的强弱与检测的浓度呈反比,其主要用于检测小分子,如FT3等,如果血清或者血浆标本中有极高剂量的游离生物素,会与未标记的生物素化抗原集合链霉素,从而导致检测结果高于实际检测结果。目前各大厂商也在相应的试剂说明书上附录及提醒。那从医生和患者的角度如何避免生物素干扰的风险?临床医生可以主动询问患者或其家属就诊当日患者是否有服用高剂量生物素药品/保健品(>5,000mcg/ 日),如有服用需停药等待一段时间后再进行抽血检测。对于一些特殊人群,例如对皮肤、指甲有保养需求的人群以及多发性硬化症患者等,尤其需要仔细询问和鉴别,如果对检测结果存疑,则重新检测样本。患者也应了解自己使用生物素补充剂的剂量,如日常有服用高剂量生物素补充剂,就诊前需提前停用,并在就诊时告知主治医生来避免风险。

   

免疫检测技术日新月异,检测新技术在带给我们更加准确,便利,快速的结果的同时,会同样带来它的部分干扰因素及限制性,如何规避其带来的风险及排除它的干扰因素,从而获得更准确的结果,是作为临床检验科所追求的,也是作为检验人的职责所在。


参考文献

  1. 李璀,免疫检测的干扰因素分析和控制措施研究[J]. 中国卫生产业,2017,(12).

  2. 彭华,高脂血标本对临床检验项目的干扰及消除[J]. 国际医学检验杂志,2010,10(30):1140-1141

  3. Dimeski G.Interference testing[J].clin Biochem。2008,29 Suppl(i):44-48.

  4. Dimeski G, Mollee P, Carter A. Effects of hyperlipidemia-on plasIIla sodium, potassium and chloride measurements by an indirect ion-selective eIectrode measuring system[J]. Clin Chem, 2006, 52(1):155-156.

  5. Int J Cardiol 2005; 101(1):27-31

  6. "Biotin: MedlinePlus Supplements". 13 September 2013. Retrieved 2013-09-29.

  7. Seaborg E. Beware of biotin. Endocrine News. January 2016.

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