空间微生物种类与检测方法及监测技术的研究

发布时间:2021-09-07       作者:彭钊 邓玉林 巴剑波 栾洁 吕雪飞       来源:临床实验室        浏览:2359       收藏: 0

【摘要】人类生活中的大部分室内环境都存在着微生物,包括处于太空环境下的载人航天器,这些空间环境下的微生物是未来进行长期载人航天所面临的重大安全性问题,对宇航员与航天器都有着不可逆的危害。载人航天器中微生物滋长会污染舱内环境,导致宇航员的患病;腐蚀航天材料,造成设备故障;甚至引起行星污染,危害地球生态安全。因此,需要对载人航天器内的空间微生物进行检测与监控,根据结果进行风险的预防与控制。本文介绍了航天器内已发现的空间微生物的种类、来源和分布,及其带来的各种危害,并总结分析了目前相关检测技术的分类和特点。对未来空间微生物检测技术进行了展望。

【关键词】空间微生物;微生物检测;微流控芯片

微生物是地球上种类仅次于昆虫的第二大生命类群,在环境中分布广,地面、水体和空气中都有微生物存在,此外,微生物的适应能力强,在极热极冷等极端环境下也能存活。因此处于太空环境下的载人航天器,如国际空间站(ISS)[1]、和平号空间站(Mir)[2]、天空实验室空间站(Skylab)[3]等都有微生物检出的报道。这些空间环境下的微生物具有潜在的巨大风险,首先,微生物的滋生会破坏航天器内的环境,污染空气、食物和水,对宇航员的健康造成严重威胁;其次,微生物的增殖会形成生物膜,腐蚀航天器材料,破坏管道、水循环系统、电连接器等部件[4];此外,微重力、宇宙辐射等极端条件会导致空间微生物在细胞或遗传学水平上与地面微生物有明显差异[5],其致病性与毒性可能会增加。随着长期太空探索计划的推进,微生物安全问题已经日趋紧迫,目前已经发展了相关的空间微生物检测与监测技术[6],用于载人航天器的微生物数量监测与多样性检测。

本文首先总结了已经发现的空间微生物的种类、来源以及它们在航天器内的分布情况,并分析了其已经及可能造成的危害;接着,分类总结了目前应用于空间微生物检测的相关技术及其各自的特点,进而介绍了微流控技术在检测方向的应用;最后,对未来长期载人航天器中空间微生物检测技术的发展进行了讨论。本文主要内容如图1所示。

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图1. 本文主要内容

一、空间微生物的种类与来源及危害

1. 空间微生物的种类:迄今为止,人们已经在载人航天器上发现了超过两百种微生物[7],其中主要是细菌(放线菌、厚壁菌门等)和真菌(子囊菌门、担子菌门等),致病细菌有金黄色葡萄球菌、链球菌等;致病真菌有黄曲霉、黑曲霉、深红类酵母菌等;具有生物腐蚀性的霉菌有黑曲霉、杂色曲霉等[8]。在所有研究中,美国航空航天局(NASA)对国际空间站(ISS)上的微生物监控最为经典。自从1998年建立开始,研究人员就对ISS的微生物水平进行了采样返地检测[9],1998至2011年期间ISS的季度样本分析结果表明,ISS中空气与表面的细菌以葡萄球菌、芽孢杆菌和微球菌属为主,真菌以青霉属、曲霉属和丝孢菌属为主。表1列出了国际空间站早期使用时检出的微生物的主要种类。

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表1. 国际空间站早期阶段检出的微生物种类

2. 空间微生物的来源及舱内分布:空间微生物种类复杂源自其来源的多样性,首先主要来源是航天员自身的微生物,这些微生物通过航天员的舱内活动源源不断地传播到舱内环境中。Lang等人对ISS上的微生物调查显示[10],已经发现的微生物中丰度最高的种属往往与人类相关。其次航天器在建造时引入的微生物污染是空间微生物种类复杂性的重要原因之一,一般情况下航天器设备只有在组件级装配时才会进入洁净间,零件更多的情况下是暴露在外部环境下,这就意味着产品在初期就会面临着微生物的附着,而它们的生命力大多非常顽强,特别是一些微生物的芽孢和孢子。这些残留进入载人航天器,遇到合适的条件就会生长繁殖,扩散到整个环境中[11]。在载人航天器这个较为封闭的环境中,另一个可能引入微生物的来源就是其运输和携带的货物(载荷、食物、水等)[12]


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表2. 国际空间站微生物负荷要求[13]

目前载人航天器内的空间微生物检测主要针对航天器表面、水体和空气三个方面,这也是微生物在舱内集中分布的地点,需要重点监控。以国际空间站为例,站内生活和工作区域的内表面、水体和空气的微生物负荷是有严格要求的。表2列出了国际空间站规定的最大微生物负荷要求。


3. 空间微生物的危害:(1)对宇航员的危害:长期在轨飞行期间,保证宇航员的身体健康是顺利完成太空任务的关键所在[14]。虽然尚无由微生物引起的严重健康问题的报道,但空间微生物对宇航员健康潜在的危害并不小。一是因为目前包括空间站在内的载人航天器已经检出各种致病菌,如金黄色葡萄球菌、曲霉等,宇航员在这样的密闭环境下无疑是有着很大的感染风险的。另外处于太空环境下,微生物的致病性与毒力可能会增强[15],感染后对健康的影响也更大。一项针对从国际空间站分离的烟曲霉的研究表明,在斑马鱼感染模型中,其毒性明显强于对照组[16]。而宇航员受太空特殊环境如微重力、宇宙辐射、节律变化等的影响,容易产生许多不利影响,包括体液再分配、肌肉萎缩、免疫反应受损及前庭器官功能紊乱等[17],从而加重了微生物感染的风险。(2)对载人航天器的危害:大多数微生物能够黏附在物体表面上并生长形成生物膜,它们不仅会损伤金属,也会破坏高分子聚合物制成的设备,进而可能导致技术故障,影响航天器的正常工作[18]。霉菌的繁殖可能造成电路板等电子元器件的短路,引起电子设备的失效,图2是国际空间站上通讯设备内部被霉菌腐蚀的情况;细菌在冷凝水系统中繁殖,产生的有机酸会腐蚀材料,造成泄露。“和平号”空间站就曾经发生聚合物结构材料遭微生物腐蚀的事故[19],其通讯交换设备控制器上的绝缘管、插头和漆面均生长附着了大量霉菌,铜导线也受到了损坏。在载人航天器的饮用水储存和分配系统中,微生物通常会形成生物膜[20],严重地会造成堵塞循环水系统,甚至水生态的污染。(3)行星污染:随着太空探索活动的增多,星球之间的生物交叉污染问题受到越来越多的关注。在深空探索任务中,要避免地球和地外星球之间交叉生物污染的活动,包括避免地球的物质污染地外星球(正向污染)以及避免带回的地外星球物质污染地球(逆向污染),预防微生物的污染就是其中重要的一环。目前,国际空间研究委员会(COSPAR)已经提出并多次更新了行星保护的相关守则[22]。例如,最早成功降落在火星表面的“海盗”系列火星探测器,在地面上经过长达三十个小时的严格灭菌后,一直处于生物屏蔽的保护下,直至到达火星大气时,生物屏蔽才被打开[23]。而且正是由于“海盗号”在火星表面没有检测到微生物活动的迹象,后续发射的火星探测器才并未采取同等严格的行星保护措施。

图2. 国际空间站上通讯设备内霉菌生长[21]

二、空间微生物检测技术及进展

1. 基于培养的微生物检测技术:载人航天器上空间微生物的传统检测方法主要以培养检测为主,即在航天器内完成样本的采集与保存,随后进行分离培养,通过对微生物生长的基本形态与特殊结构进行观察来分析结果。图3是在国际空间站上进行采样并返回地面培养检测的结果[24],整个检测过程可以分为采样保存与培养鉴定两部分。国际空间站内配置了一种在轨的采样工具包,包括表面采样工具(SSK)、空气微生物采样器(MAS)和水样收集工具(WSCK)等。培养鉴定两种方式为在轨培养和返回地面后在实验室内进行培养鉴定分析。

                                图3. 培养鉴定分析[24]

国外的经验表明,基于传统的培养方法进行空间微生物的检测是简单实用、稳定可靠的,可以作为评价载人航天器内环境的重要标准,目前培养检测正在向在轨培养检测方向发展。但是在轨培养检测也存在一些限制:(1)很多微生物种类不能在传统的培养基上生长,因此无法用培养法检出;(2)分析时间较长,无法进行快速检测;(3)在轨培养时可能导致有害微生物的增殖,容易造成污染。因此目前各国正在积极改进或研发免培养的空间微生物检测技术,主要以核酸相关检测技术与生理生化检测技术为主。

2. 基于核酸的微生物检测技术:核酸序列是生物独特的识别密码,通过检测载人航天器上留存核酸信息可以实现对空间微生物的快速检测。目前采用的主要的核酸检测技术有聚合酶链式反应(PCR)与基因测序技术两大类。PCR技术是核酸检测中不可或缺的技术,进行PCR首先需要完成对样品的核酸提取和纯化浓缩,在空间环境下由于条件受限,通常采用物理和化学的方法将生物细胞裂解,释放出核酸,然后使用磁珠过滤柱进行核酸提取[25],然后进行变性、延伸、复性等循环扩增。在传统的PCR技术之外,目前也出现了等温扩增技术(如环介导等温扩增技术)[26]、实时荧光定量核酸扩增(RT-qPCR)[27]等核酸扩增检测技术。2015年国际空间站搭载了利用RT-qPCR原理进行空间环境下基因定量分析的实验系统—WetLab-2(图4),该系统可以对包括从微生物到哺乳动物在内的生物组织样本进行在轨的RNA分离纯化和RT-qPCR分析。在轨测试时使用三种不同浓度的预加载的大肠杆菌基因组模板,得到了与地面控制组无显著性差异的结果,为国际空间站上的快速医学诊断和生物环境监测开辟了新的可能性[28]

                                图4. WetLab-2实验系统[28]

基因测序技术,尤其是第二、三代测序技术是另一种具有空间环境应用潜力的微生物检测技术。通过对微生物的16S rRNA进行测序分析可以对其群落组成进行多样性分析,从而实现空间微生物的快速检测。2016年NASA约翰逊空间中心将生物分子纳米孔测序仪“MinION”部署进入ISS,MinION重量仅有86克,尺寸为9.5×3.2×1.6厘米,它包含2048个能够测序的蛋白质纳米孔,能够实现快速地DNA测序。作为测序仪在空间应用的验证[29],2017年,研究人员使用MinION测序仪进行了空间站与地面的对照测序实验,实验流程如图5,该实验对国际空间站上培养分离的三种细菌菌落进行了鉴定,部分样品在空间站上使用MinION对16S RNA进行测序分析,剩余样品送返地球进行包括桑格测序在内的多种方法分析,对照结果显示菌种识别准确度非常高。

                                图5.“MinION”在轨与地面测序的工作流程[29]

3. 基于生理生化的微生物检测技术:除了核酸相关的检测技术,科学家们还开发出了利用微生物特殊的生物因子来实现快速检测的相关技术,如利用质谱法(MS)来鉴定空间微生物的蛋白质[30]、基于ATP法来检测样品中的微生物负荷[31]以及基于内毒素的微生物分析法等[32]。NASA开发了一款便携式测试系统 (LOCAD-PTS),利用比色原理对革兰氏细菌的内毒素的测量来评估ISS环境中的微生物污染[33]:LOCAD-PTS试剂盒套件是基于鲎变形细胞溶解物(LAL)与细菌的内毒素-脂多糖(LPS)的反应原理来检测微生物,整个组件主要分为读取器、墨盒(内含试剂)和拭子套装三部分,目前利用LOCAD-PTS已经在ISS的运动、卫生、睡眠和餐饮设施等多个区域表面检测出相当程度的内毒素。

                                图6. “LOCAD-PTS”检测设备[33]

4. 基于微流控芯片的空间微生物检测技术:(1)微流控芯片技术及其空间应用:微流控芯片技术是一种在微小通道或构件中微米级尺寸的流体进行操控的技术,具有灵敏度高、体积小、响应速度快等特点,近年来被逐渐应用于空间实验领域。空间微流控芯片的一大应用是培养与检测,因为微流控芯片克服了传统培养实验载荷大、耗时长、成本高等局限性,可以进行细胞、微生物等的快速、微量的培养,结合自动化的检测模块,可以实现培养与检测的一体化、自动化和集成化。例如NASA开发的BioSentinel芯片载荷,利用酵母的DNA损伤修复机制检测辐射剂量,研究低地球轨道以外的空间辐射对生物体的影响[34],BioSentinel载荷由生物传感器(4U Biosensor)与辐射光谱仪(LET spectrometer)组成。其中,微流控芯片是生物传感器的核心部分,尺寸为3.9×4.1×1.3cm,主体由两块熔融的聚碳酸酯(PC)制成,每块芯片包含16个体积为100μl的微孔。酵母会提前以干粉的形式储存在芯片内,装配到载荷的生物传感器部分,并随卫星发往深空以检测辐射[35]。目前载荷已完成测试,即将进入太空。(2)微流控芯片技术在微生物检测中的应用:基于微流控芯片技术的检测速度会更快,比传统方法消耗更少的样本和试剂量。此外微流控芯片是封闭或一次性的,可以有效降低微生物的污染风险,更换起来也非常方便。目前微流控芯片技术已经开始应用于微生物的检测,例如Dalal等人[34]利用荧光染色的原理设计了相应的微流控装置和便携式的设备来检测水体中致病菌嗜肺军团菌的数量,用于保证公共环境中的微生物安全,图8是相应的芯片与检测装置,样本与荧光染料同时进入芯片并混合,嗜肺军团菌此时被荧光抗体染色,随后利用检测系统在芯片检测窗口进行计数,由此完成整个检测过程。

                                图7.“BioSentinel”载荷与培养芯片[34]

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                                图8. 用于检测水体中军团菌的微流控芯片[34]

                                图9. 用于检测致病菌的微流控芯片

注:A/B. Park等设计的旋转芯片实物图与结构设计[36];C/D. 用于核酸扩增的旋转芯片实物图与荧光检测装置模型图[37]


目前也有研究将核酸提取、扩增和检测的整个过程集成到一个微流控设备中,其中利用毛细管力和离心力驱动的微流控设备是目前比较有潜力的方向,它们无需使用复杂的微阀和管道来控制集成化的功能单元。Park等人[36]开发的一种集成的旋转微流体装置,结合了DNA提取、环介导等温扩增(LAMP)以及侧向流试纸条,实现对致病菌的快速检测(图9A和图9B);Ye等人[37]开发的一体化微流控核酸诊断系统:使用可旋转的微流控芯片为载体,实现了对沙眼衣原体、淋病奈瑟氏菌等病原体的快速扩增检测(图9C和图9D)。在扩增过程中,芯片会旋转,每个反应孔依次通过荧光检测孔,从而可以获得扩增过程中的实时荧光信号,其检测结果可以与常规PCR方法媲美。经过进一步的发展,集核酸提取、扩增和检测于一体的微流控芯片必将在空间微生物的检测和监测中发挥重要作用。

三、总结与展望

在载人航天发展的早期阶段,自人类首次载人航天飞行起(尤里·加加林,1961),美国和苏联就开始采用传统的培养方法对飞行舱内的微生物进行监测。到目前为止,大多数情况下采用的空间微生物检测技术还是以传统培养为主,不论是在轨培养还是采样返回地面进行检测,传统方法都具有简单实用、稳定可靠的优点,但是也具有时间长、检测范围小、培养过程容易造成污染等不足。因此空间微生物检测技术的逐渐向非培养、集成化的快速检测方向发展。而微流控芯片技术正以其独特的优势在快速检测得到广泛的应用,包括NASA在内的多个研究机构正在开发基于微流控技术的快速检测设备,未来这些设备将助力安全、可持续的长期太空居住,除此之外,这些检测技术还可用于各种行业,例如制药、食品生产以及临床环境中的即时诊断技术。


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