二代测序技术在临床诊疗中的应用进展与展望

发布时间:2021-07-06       作者: 卓钟灵       来源:临床实验室        浏览:2401       收藏: 0

作者:赵晓涛  卓钟灵

Sanger测序在过去的二十年间是基因组研究的主流方法,取得了包括人类基因组计划(human genome project, HGP)等一系列重大成就,这使得单基因遗传病的鉴定和靶向治疗成为可能[1,2]。随着基因组大数据时代的到来,尽管Sanger测序是基因检测的金标准,但是研究人员依旧迫切需要更快、通量更高的测序方法,二代测序(next-generation sequencing,NGS)技术应运而生,它能够在短时间内产生海量数据[3,4],目前二代测序仪平台主要为Illumina和Thermo Scientific。Illumina公司测序仪采用边合成边测序的方法,基于可逆终止化学反应原理,检测测序时产生的荧光信号,而Thermo Scientific公司平台测序仪基于半导体测序原理,检测测序时产生的电信号。两种平台各有优缺点,在临床不同的需求中得到应用。

NGS已经应用于临床许多领域,在辅助生殖,如非侵入性产前检查(non-invasive prenatal test,NIPT);遗传性疾病,如遗传性致病突变筛查;肿瘤研究,如早期诊断,用药指导,预后判断等中发挥着越来越重要的作用。柳叶刀发布的中国疾病负担研究显示,肿瘤和心血管疾病占比高且患病人群巨大,给家庭和国家造成了巨大的经济负担,急需新的检测手段精准指导临床诊疗[5]。此外,感染性疾病因病原体种类复杂并且传统方法鉴定周期长且困难,也急需高通量的检测方法。本文针对目前二代测序技术除了NIPT之外应用较为广泛的领域:肿瘤、心血管疾病和感染性疾病中应用进展进行了总结。 NGS 可应用于全基因组测序( whole genome resequencing,WGS)和全外显子组测序(whole exome resequencing,WES),可获得点突变、小片段插入或缺失、拷贝数变异和结构变异的信息。全转录组测序方法(RNA-Seq)不仅可以检测基因表达谱,还可以检测可变剪接,RNA编辑和融合转录本。此外,可以使用包括染色质免疫沉淀测序、甲基化分析测序等方法研究表观遗传变异。同时研究人员利用强大的生物信息学工具,破译大量数据,以提高我们对疾病的理解,制定个性化的诊疗策略。

一、二代测序在肿瘤诊断中的应用

1. 基于NGS进行多种癌种的研究:在过去的几年中,很多基于NGS的研究已经开展,以提供癌症的综合分子景观,识别有助于肿瘤发生,进展和转移的新的遗传改变,并研究肿瘤的复杂性、异质性和肿瘤 的进化。在乳腺癌[6-13]、卵巢癌[14]、结直肠癌[15,16]、肺癌[17]、肝癌[18]、肾癌[19]、头颈部癌症[20]、黑色素瘤[21]、急性髓性白血病[22,23]等癌症中均取得了研究成果(表1)。

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2. 识别新的癌症相关基因:癌症主要由遗传突变 的累积引起,遗传突变可以在胚系中遗传或在体细胞 突变中获得。原癌基因、抑癌基因和DNA修复基因的改 变使细胞逃避生长和调节控制机制,导致肿瘤的发生[24]。癌细胞也可能进一步突变,导致克隆性扩增[25]。 随着克隆性扩增的发展,癌细胞最终会侵入其周围组织 并转移到原发肿瘤的远端区域[26]

癌症基因组的测序识别了很多新的癌症相关基因, 特别是在乳腺癌中。有6篇文章报道了他们对大型乳腺 癌数据的研究结果:TCGA(癌症和肿瘤基因图谱计划) 对来自507名患者的510份样本进行了外显子组测序[6], Banerji对103个样本进行外显子组测序,对46个样本进 行了全基因组测序[8],Stephens对100个样本进行了外显 子组测序,Shah对65个样本进行全基因组/外显子组测 序,对80个样本进行RNA测序[12],Nik-Zaina对21个肿瘤 /正常对照样本进行全基因组测序[13]。除了确认TP53, GATA3和PIK3CA中的频发性体细胞突变外,这些研究还 发现了新的癌症相关突变。尽管新的突变发生频率低 (<10%),但是特定基因的突变发生在乳腺癌的不同 亚型中,并归属于不同的通路。例如,MAP3K1的突变经 常发生在Luminal A型乳腺癌患者中[6,8],涉及p53,染色 质重塑和ERBB信号传导通路的基因在乳腺癌中突变频率 较高[12]。此外,一些突变可以用作治疗位点,如GATA3 的突变可能是芳香酶抑制剂疗效的阳性预测标记物[8]

基因组的测序还有助于完善结直肠癌的突变谱。 例如,对72对肿瘤/正常组织配对样本进行外显子组测 序鉴定出36,303个导致蛋白变异的体细胞突变。对显著 突变基因进一步分析归纳出23个候选的癌症基因,包 括KRAS,TP53和PIK3CA,以及新的基因,例如调节细胞 周期检查点的ATM。RNA测序鉴定了频发性的R-spondin 融合,可能加强Wnt信号传导并诱导肿瘤发生[16]。另一 项研究对224对肿瘤/正常组织进行外显子测序,该研究 鉴定了超突变癌症中的15个高度突变的基因和非超突变 癌症中的17个高度突变基因。在非超突变的癌症中,除 了已知的APC,TP53和KRAS突变之外,还检测到SOX9, ARID1A,ATM和FAM123B中的新的频发突变。对SOX9, ARID1A,ATM和FAM123B的突变和功能作用的分析表明它 们是高度潜在的结直肠癌相关基因。并发现非超突变的 结肠癌和直肠癌在基因组变异中具有相似的模式。最 后对97例肿瘤样本的全基因组测序识别了频发的NAV2- TCF7L1融合[15]

3. 深入揭示肿瘤的异质性和进化:使癌症成为一 种难以治愈的疾病与每个克隆中选择和遗传不稳定性导 致的肿瘤进化和异质性有很大关系[27]。这设想最初由 Peter Nowell作为癌症的克隆进化模型于1976年提出, 试图解释一段时间内肿瘤侵袭性的增加。其它研究人员 在20世纪80年代研究了来自小鼠肉瘤细胞系的转移性亚 克隆从而进一步支持了这一理论[27]

NGS的广泛应用揭示了肿瘤异质性和肿瘤进化的机 制。通过不同的形态学表型、表达谱和突变以及拷贝数 变异,将肿瘤分成不同亚型[28-31]。在TCGA和Eillis的研 究中发现mRNA表达亚型与体细胞突变有关[6,8]。NGS检测 出的大量的体细胞突变展现出个体肿瘤的独特性,每个 都包含不同的突变模式。例如Stephens在100位乳腺癌 患者中发现73种不同的癌基因突变组合可能[10]

肿瘤内异质性可以阐释为单个肿瘤内的非同一性 细胞克隆或亚克隆,提示不同的组织学,基因表达,转 移和增殖潜力。高灵敏度的优点使NGS成为研究肿瘤内 异质性的有力工具。一项基于NGS的4例患者肾细胞癌 研究成功地阐明了肿瘤内异质性[19]。对于患者1,在原 发肿瘤的9个区域中发现的128个经验证的突变中,40个 普遍存在,59个在一些区域共有,29个在特定区域是独 有的,表明肿瘤异质性存在并且是“持续的区域克隆进 化”[19]。最重要的是,该研究表明,单个肿瘤活检仅 显示肿瘤突变的一小部分;单个活组织检查中,可检测 到该肿瘤中所有突变的55%,并且大多数肿瘤区域约有 34%的共有突变。

癌细胞的持续和平行进化可以建立和维持肿瘤内异 质性。例如,在前列腺癌肿瘤细胞水平观察到显著的空 间,细胞内和细胞间异质性。在不同患者中观察到单克 隆起源和多克隆模型[32]。肾细胞癌研究中患者1和2中 肿瘤区域的系统发育关系揭示了肿瘤的分支进化而非线 性进化[19]。研究还显示了乳腺癌进化的分支结构[27]。 根据“肿瘤生长的树干-分支模型”[27],促进肿瘤生 长的体细胞突变,代表了肿瘤发展早期树的树干。这 些体细胞突变很可能在这个阶段无处不在。随着时间 的推移,其他被称为驱动因素的体细胞突变会导致 肿瘤异质性发生,从而导致肿瘤和转移部位发生分支 进化。之后,这些分支将进化并变得更加孤立,导致 “瓶颈效应”,继而使得染色体更加不稳定,肿瘤异 质性进一步扩大[27]。这致使肿瘤在不断变化的环境中 产生适应和生存的能力,并影响药物治疗的疗效[19]。 因此,重要的是检查肿瘤克隆结构并识别位于系统发 育树的树干中的常见突变,这可能有助于理解靶向治 疗抗性并发现更强大的治疗方法。

二代测序在肿瘤中的一些研究成果已经应用于临 床,为患者早期筛查、预后判断和靶向用药提供了有 力的证据。二代测序在肿瘤精准医学诊断中的应用专 家共识也陆续出台[33],随着二代测序技术的不断发展 和对癌症研究的不断深入,二代测序技术将为癌症治 疗的突破提供新的希望。

二、二代测序在心血管疾病诊断中的应用

1. 二代测序在心血管疾病研究中的应用潜力巨大:NGS已被证明可成功鉴定出单基因疾病和心血管 系统常见疾病的新型致病突变[34]。NGS在常见心血管 疾病(cardiovascular diseases,CVD)中正变得越来 越重要,因为与仅提供已知单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)数据的全基因组关 联研究(genome-wide association study,GWAS) 不同,它可以提供更多信息,包括常见和罕见变 异,插入缺失和删除,和拷贝数变异(copy number variants,CNV)[35]。NGS提供了对大量基因进行并行 分析的机会,这些基因可能有助于增进我们对诸如 CVD之类的复杂疾病的认识。在鉴定较小家系中的稀 有变异时,它也是一种有用的方法。心血管领域中 孟德尔疾病的例子包括家族性高胆固醇血症,肥厚性 和家族性扩张型心肌病和离子通道病(即Brugada和 长QT综合征)[36],而临床实践中最常见的CVD则更为 复杂,例如冠状动脉疾病(coronary artery disease, CAD)和中风是由复杂的因素导致的基因-基因和基因 -环境相互作用[37]。基因检测不仅被用作研究工具, 而且由于其有潜力为家庭提供更多个性化和信息性的 咨询服务,因此最近也进入了临床诊断领域[38]

2. 二代测序揭示单基因心血管疾病中的致病变异:NGS的进展正在改变我们对杂合性家族性高胆固 醇血症的流行性评估和对多基因效应的认识。最近, Wang等[39]发现,靶向NGS检测的单基因突变存在于近 一半的严重高胆固醇血症的个体中,定义为LDL-Cl> 5.0mmol/L。当包括拷贝数变异和具有极端多基因得 分的个体时,具有单基因突变的个体的百分比增加到 53.7和67.1%。在2011年,Meder等人[40]首先采用靶向 NGS方法筛查遗传性心肌病患者。他们采用了含有47 个基因的组合来检测10例肥厚性心肌病和扩张性心肌 病患者的血液,并发现了27个新的可能有害的突变。 在另一项WES研究中,对13个亲子后代和112个非综合 征性房室间隔缺损随机个体进行了研究,研究人员确 定了新的与先天性心脏病相关基因NR2F2相关的几种 致病变异。Sakai H[41]使用了两种不同的技术,即重测 序阵列技术(ResAT)和NGS,分析了70例非综合征患 者(35例胸型,30例腹型和5例胸和腹型)中与综合 征性主动脉瘤和/或夹层相关的8个基因。在2011年发 表的一项研究中,使用Illumina GA平台,分析了来自 HapMap CEU人群的47个欧洲血统随机个体中9p21染色 体上大约240kb区域的数据[42]。在迄今为止最大的一 项外显子组研究中,在来自更广泛的4204个随机个体 的外显子组样本中的496名缺血性中风患者中,发现 对氧磷酶-1基因的七个变异与缺血性中风有关[43]。此 外,旨在生成和存储WES数据的国际项目,如英国基 因组学100,000染色体基因组计划[44],将可用于鉴定对 卒中的病理生理影响很小但意义重大的多种变异。

3. 二代测序揭示具有复杂特征心血管疾病中的 遗传背景:NGS技术还用于其他具有复杂特征的CVD相 关疾病,包括血栓形成,高血压和血脂异常。在有血 栓形成记录的家庭中,NGS已通过将Illumina平台应用 于引起遗传性血栓形成的多基因风险检测并获得适当 的药物治疗[45]。在这项研究中,鉴定出200个变异, 并使用HapMap不同人群对其进行了评估。此外,正如 Costa等人所指出的,多种基因与多种心血管疾病的关 联,高血压是中风和冠心病的主要危险因素,占所有 心血管疾病死亡率的50%,其遗传因素被认为占30%到 50%[46]。最后,萨达南达等人结果表明,NGS方法可以 可靠,准确地检测大量低水平高密度脂蛋白胆固醇患者 的致病变异-这是最常见的脂质异常之一,也是CVD的 关键危险因素[47]

通过对患者的整个外显子组(或基因组)进行重 测序,揭示了在孟德尔疾病研究中NGS可能是有效的方 法[48]。此外,将这些技术应用于复杂疾病,包括CAD和 其他CVD,可能会更深入了解这些疾病的遗传背景,可 以实现检测结构变异和罕见变异,以及将不同类型的变 异与表型联系起来的挑战。2009年,美国国家心脏,肺 和血液研究所(NHLBI)的外显子组测序项目(ESP)成 立,目的是发现与心脏,肺和血液相关疾病有关的稀 有蛋白质编码变异。为了确定与CVD相关的罕见变异, 使用外显子组测序来诊断心血管队列的良好表型[47]。 如前所述,WES和WGS已鉴定出许多在孟德尔疾病和复 杂CVD条件下均重要的罕见变异。尽管WGS的覆盖范围比 WES好(外显子组几乎占整个基因组的1%),但由于成 本高和序列读取深度低,在大量个体中使用WGS仍不可 行,WES可能是一种中间可行的方法。WGS绝对是进行基 因检测的最佳选择,尤其是在心血管疾病中。由于非编 码变异在增加CVD风险中起着显著作用,并且测序成本 不断降低,因此在将来,WGS将比WES具有更高的成本效 益。WGS在揭示未知遗传疾病的病因以及诊断具有非典 型表现的已知疾病的患者中更有用。此外,可以通过使 用功能基因组学方法(例如RNA-seq和ChIP-seq)来开 辟检测疾病相关的生物学途径的新方法。除了确定这些 疾病的环境危险因素外,阐明CVD的遗传背景还为精确 有效的治疗提供了新方法,NGS技术为个性化医学的发 展指明了道路。

在心血管医学中,NGS已被证明可以成功地识别新 的致病突变,并可以诊断由单个基因中的单个变异体引 起的孟德尔疾病。NGS提供了以无偏见的方式(即不了 解潜在的生物学机制)对大量基因进行并行分析的机 会,这可能有助于增进我们对诸如CVD之类的复杂疾病 的病理学的认识。

三、二代测序在感染性疾病诊断中的应用

在过去的五年中,NGS的应用已从研究工具过渡到 诊断方法,并且在临床微生物学实验室中变得越来越普 遍。这些应用包括(1)全基因组测序(WGS),(2) 靶向二代测序(tNGS)方法和(3)宏基因组二代测序 (mNGS)。

1. 全基因组测序在感染性疾病中的应用:WGS应 用于微生物基因组的测序和组装。迄今为止,WGS的最 普遍用途是鉴定,分型和/或预测微生物病原体的药敏 性。通过识别和跟踪疫情,WGS已被证明在医院和公共 卫生流行病学研究中具有重要的作用。例如,WGS能够 检测和监测产生CTX-M-15的肺炎克雷伯菌克隆和产生 大肠粘菌素的碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌的传播,从而 指导感染,控制干预措施并防止这些多药耐药微生物的 进一步传播[49]。WGS用于从新生儿重症监护病房的患者 中分离腺病毒基因组从而有助于识别和遏制疫情暴发, 并且比通过Sanger测序进行分型具有更好的分辨率[50]。 此外,WGS用于检测腺病毒阳性环境样品,从而确定感 染的途径,并导致感染防控方式的改变[50]。除了医院的 流行病学和感染控制应用之外,WGS还支持公共卫生计 划,以迅速发现,应对和阻止病原体的传播[51, 52]。WGS 允许对潜在暴发菌株及其相关性进行更深入的探索,从 而使人们对暴露和传播的途径有了更好的了解[53, 54]。 除了识别和跟踪暴发,WGS还提供有关病原体毒力 和新的耐药机制检测的未开发信息。可通过鉴定毒力因 子基因来研究毒力,目前,毒力因子基因尚未被临床实 验室检测到,也未用于患者的治疗和管理决策中。例 如,一项研究强调了其在金黄色葡萄球菌中检测和分选 某些毒力基因(例如spa和PVL毒素)的潜在实用性[55]。 此外,WGS可以提供对耐药新机制的早期检测,而传统 的分子检测方法(例如特定基因或基因座的聚合酶链反 应(PCR)可能会错过这种机制)。WGS在检测新突变中 的价值的一个例子是在结核分枝杆菌中发现Rv3792的同 义突变,该突变可通过增加下游embC基因的表达从而 导致乙胺丁醇MIC升高[56]

这与上述应用相似,WGS还可以提供对病毒病 原体及其耐药性的更详细分析。尽管目前可以通过 Sanger测序对一些病毒病原体(主要是人免疫缺陷病 毒(HIV)和巨细胞病毒(CMV))进行耐药性的遗传 检测,但仍在探索WGS对其的应用。一项使用针对HIV 的全基因组关联研究的研究能够准确地检测5种遗传 关联,这些关联导致已知的氨基酸改变,从而赋予耐 药性[57]。病毒WGS方法最大的潜在优势之一是能够检 测出Sanger测序无法检测到的耐药亚群。一项研究表 明,在HIV的检测中WGS可以提高检测HIV-1的低频耐药 突变的敏感性[58]

WGS最令人兴奋的潜在应用之一是其预测抗药性 (AMR)的能力,与传统的表型方法相比,它可以更 快地提供初步结果。许多发表的报告显示了将WGS用 作检测各种细菌耐药性的分子抗菌测试方法的希望, 这表明耐药基因型与表型结果之间具有高度相关性。 一项研究表明,针对15种抗菌药物测试的76株肠杆菌 具有97.8%的特异性和99.6%的敏感性[59]。在其他测试 肺炎克雷伯菌的研究中,观察到相似的敏感性和特异 性(≥90%)[60, 61],铜绿假单胞菌[62],金黄色葡萄球 菌[49]和淋病奈瑟菌[63]也有这种情况。最近,已经基于 WGS应用了机器学习模型来预测抗生素的最小抑菌浓 度,非伤寒沙门氏菌的平均准确度为95%[64],肺炎克 雷伯菌为92%[61]

2. 靶向测序在感染性疾病中的应用:tNGS在文 库制备和测序之前使用选择过程来富集目标微生物 序列。可以通过多种选择方法来实现富集,例如PCR 扩增(通常称为扩增子测序),探针杂交以及利用 CRISPR-Cas9[65,66]。tNGS优于宏基因组学方法的优势在 于,它克服了在大量细胞样本中扩增少量微生物序列 的“大海捞针”的难题[67]。但是,富集过程(例如, 针对特定基因的多重PCR)可能会导致结果偏倚。 对于tNGS的临床应用,主要目标是鉴定患者样本 中的一种或多种微生物病原体。但是,这些测定法 也可能针对抗生素抗性基因。迄今为止,用于临床 应用和微生物组研究的最普遍的富集方法是在NGS之 前通过PCR扩增16S核糖体RNA(rRNA)基因[65,68,69]。但 是,富集的替代方法也正在开发中[70]。Sabat及其同 事开发了一种细菌tNGS分析方法,该方法可通过PCR 扩增并对疑似尿路感染,血液培养阳性和骨科患者的 尿液样本中的整个16S-23S rRNA区域进行测序。与常 规培养,通过商业系统鉴定和16S Sanger测序相比, 16S-23S tNGS分析可准确识别血液和尿液中的病原 体,并显示出骨科样本中细菌病原体检出率的增加。 除了单纯的tNGS分析外,还在开发更大的多重检 测组合。已经描述了使用多重探针富集步骤的两种检 测方法,用于血液和组织样品中的病毒(VirCapSeqVERT)和细菌(BacCapSeq)检测[71,72]。两者都使用 2到400万个探针池来分别选择性覆盖300多种细菌和 200种病毒物种的微生物序列,包括前者的AMR标记和 毒力决定因素。与特定的单重PCR相比,这些检测方 法显示出相似的检出限。VirCapSeq-VERT已在临床上 应用,将其与mNGS进行了比较,以确定来源不明的 发热病原体[73]。尽管两种方法都可以鉴定出相同的物 种,但与宏基因组方法相比,VirCapSeq具有更高的灵 敏度。

3. 宏基因组测序在感染性疾病中的应用:mNGS 是一种可以直接从患者标本中检测全部核酸的方法。 与tNGS方法不同,该方法不会选择性地扩增特定靶 标,因为样品中的所有核酸均会被并行扩增和测序, 从而可以无偏的检测所有微生物组(即细菌,病毒, 寄生虫和真菌),抗药性标记,毒力因子,甚至是与 不同疾病状态相关的宿主生物标记。这提供了直接从 患者样本中进行无假设诊断的优势。包括《中国宏基 因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专 家共识》[74]等在内的一系列共识已由国内专家提出, 共识中指出了如何避免宿主基因干扰,如何判定是否 是致病菌,如何解读结果等临床应用疑难点,表明宏 基因组测序在临床感染性疾病中的应用需要在技术方 法等层面进一步完善。

方法学的变异包括基于DNA和RNA(也称为宏转录 组学)的方法,可从感染源或无细胞DNA(cfDNA)中检 测出完整的微生物。cfDNA(来自死亡的溶解的微生物 的小核酸片段,被过滤到血液或尿液中)可以提供远端 感染部位(例如,肺炎期间的肺部)的信息。重要的是 要了解这些方法的差异和局限性。例如,如果在mNGS 中未包含基于RNA的方法,则将无法检测RNA病毒,或者 将无法基于转录组的分析来研究宿主的免疫反应[75]。 mNGS方法学也是目前尚缺乏标准化的复杂,多步骤的 过程,这也使结果解释变得更加复杂[76]

事实证明,mNGS作为诊断工具可成功检测出多个 部位(包括中枢神经系统)的感染,包括血液,呼吸系 统,胃肠道,假肢关节,尿路和眼部。确定的病原体包 括细菌,分枝杆菌,RNA和DNA病毒,酵母,霉菌和寄 生虫。在其中一些情况下,大量的标准诊断工具无法使 用。mNGS在检测新型的,罕见的,和非典型原因或以 前接受过治疗的患者方面特别成功。

最近的一些研究表明,与护理标准诊断相比, mNGS的敏感性更高,对mNGS的前景具有指导意义。苗 和同事的一项研究[77]观察了511种不同来源的标本的比 较性能。回顾性图表显示,mNGS的整体临床敏感性和 特异性分别为50.7%和85.7%,标准诊断法的整体临床敏 感性和特异性分别为35.2%和89.1%。mNGS特别适用于结 核分枝杆菌,病毒,厌氧菌和真菌。但是,同一项研 究还表明,对于常见的细菌感染,尤其是在以前没有 抗生素暴露的情况下,通过mNGS进行的检测并不优于 培养。类似地,来自假体关节感染的超声液或滑液的 mNGS在培养阴性病例中分别提供了25%和18.3%的增量产 率[78,79]。另一种情况下,使用mNGS检查至今仍未明确诊 断病原的94例亚急性或慢性脑膜炎患者的脑脊液,鉴 定出2例猪带绦虫,1例HIV-1,4例真菌和1例蛛网膜下 腔神经囊虫病[80]。这项研究表明,通常存在大量检测 阴性病例[81],但是,mNGS具有识别未知的病原体的潜 力,并有助于疑难患者的治疗[82,83]

大多数最初的研究都集中在病原体检测上。但是, 当覆盖范围足够大时,mNGS也可用于对一种或多种主 要病原体进行菌株鉴定,或直接从标本中检测AMR和毒 力因子基因。对于具有较小基因组的病原体,例如病毒 则更为容易。例如,在随后的继发性非性传播病例中, 对流行地区中与血液有关的寨卡病毒株进行分型[84]。 严最近应用CosmosID生物信息学平台查询mNGS结果葡 萄球菌呈阳性,mecA介导的甲氧西林耐药性检测具有 77.4%的敏感性和100%的特异性[85]。最后,可以查询基 于RNA的方法中的宿主序列以研究免疫反应并将其整合 到诊断算法中,以帮助确定微生物序列的重要性。令人 印象深刻的是,Langelier和同事在下呼吸道感染中结 合病原体,微生物组和宿主转录组分析,获得了100%的 阴性预测值[86]

WGS在公共卫生实验室中应用广泛,有助于快速识 别和跟踪传染病暴发,并检测新出现的耐药性和进行 监测。tNGS在临床微生物学中未得到充分利用;然而, 新的富集方法的发展将允许广泛的病原体检测和高灵 敏度。将来,tNGS可能会成为一种更易于使用的检测方 法。宏基因组下一代测序已成为一种有前途的单一、通 用病原体检测(即细菌,真菌,寄生虫,病毒)方法, 可直接从临床标本中进行传染病诊断。

四、展望

NGS作为一项突破性技术,使分子诊断迎来了新的 机遇,同时也面临着许多挑战。目前有临床实验室已 经采用NGS技术来识别变异,进行精确肿瘤学和心血管 疾病的基因图谱分析以及对感染性疾病进行病原体检 测。NGS目前获批诊断器械注册的产品包括NIPT检测试 剂盒,非小细胞肺癌和乳腺癌基因突变检测试剂盒等。 NGS技术和生物信息学工具将继续发展,并成为基因组 分析的主要诊断手段和治疗标准,以满足精准医学不断 增长的需求。

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