宏基因组检测技术与临床实验室检测要求

发布时间:2021-03-18       作者:王 珺       来源:临床实验室        浏览:2414       收藏: 0

作者:王 珺   刘 超   石瑛琪

基于二代测序技术(next generation sequencing,NGS)或称高通量测序技术的病原微生物宏基因组检测(metagenomics next generation sequencing,mNGS)是新近发展起来的一种快速、高通量的获得核酸序列信息的技术,在过去10年极大的推动了人类微生态学研究和微生态对人体健康影响的理解。自2014年在《新英格兰医学杂志》上首次报道一例用二代测序技术诊断钩端螺旋体感染的病例以来,其诊断价值已迅速被认可[1]。由于常见病原微生物均含有核酸,mNGS通过核酸序列可明确病原体的种类甚至部分耐药基因信息,另外由于其超高灵敏度、检测周期快和非培养依赖能力且不受人类基因组DNA干扰等优点,mNGS已作为一种新兴和强大的技术用于医学微生物学,可能成为一种快速的、普适的感染性疾病病原体的诊断方法。

相比常规的分子生物学技术如荧光定量PCR,mNGS的实验流程也更复杂,操作环节多,对试剂质控、实验室污染控制和人员的专业技术要求更高。本文对mNGS检测及相关实验要求作探讨。

一、 实验室分区及人员要求

1. 生物安全要求:待测样本中可能含有较高传染性的病原微生物,因此样本处理区需要有严格的分区和负压,需要具备II级生物安全柜。废弃样本、废液处理应制定相应的操作程序,所有的危险性废弃物必须依照统一的容器和标示方式,完整并且合规地标示废弃物内容。建议参照国家卫生健康委办公厅颁布的新型冠状病毒实验室生物安全指南(第二版)对废弃物进行处理[2]

2. 人流物流严格分区:因为mNGS的建库方案和操作流程不同,对于实验室的布局要求不同。如果建库环节包含PCR扩增,需严格按照核酸扩增实验室管理办法管理。如果采取靶向多重PCR扩增建库(一般需进行两轮PCR),则需要有试剂准备区、样本制备区、扩增区、扩增后区、样本制备二区、扩增二区、扩增后二区等两套独立的PCR实验室分区,尽可能降低PCR气溶胶造成的交叉污染。mNGS检测灵敏度高,在布局上不得与微生物培养在同一个实验分区进行实验。

3. 人员能力要求:实验室应具备分子生物学实验背景的技术人员,推荐获得国家要求的相应资质、微生物实验资质、基因扩增实验资质。实验室具备生物信息分析能力,熟悉数据结构、更新数据库、对于新发病原体进行全基因组拼接等。审核人员需具备临床医学、微生物学、高通量测序背景知识。

二、mNGS检测技术对实验室的要求

mNGS可以分为鸟枪法宏基因组测序、16S测序和靶向测序三大类。

鸟枪法宏基因组测序(shotgun sequencing):对样本中提取的所有核酸进行无偏倚的建库和测序,测序结果过滤人源序列,再与已知的微生物数据库比对,进行属种鉴定。可以检测所有已知基因序列的微生物,包含细菌、真菌、病毒、寄生虫[3]

16S测序(16S rRNA Sequencing):根据细菌基因组上高度保守的编码核糖体蛋白的16S rDNA基因序列设计通用引物,对可变区(V3和V4)进行扩增,获得平均450bp的扩增片段,再通过建库测序获得每个样本不低于5万条序列。为了简化运算,将这些标签序列进行聚类,生成数百个OTUs(最小可分类单元),通过和RDP(核糖体数据库计划)数据库的比对分类。该方法主要针对细菌,不适用于真菌、病毒、寄生虫等病原体[4]。 

靶向测序(tNGS):针对已知基因序列的几十-几百种微生物设计多重PCR引物或核酸探针,对样本提取的核酸进行靶向富集,富集后的核酸进行常规建库测序。因为只针对目标微生物进行建库测序,数据量只需1~2M reads。该方法主要适用于定向的微生物panel,覆盖范围较小[5]

1. 样本前处理:对液化(痰液)、破壁(匀质、超声)、离心、去宿主/去人源等样本前处理操作和使用的仪器设备应进行充分的性能验证。mNGS检测需要尽可能覆盖所有病原微生物,因此样本前处理步骤需要考虑同时兼顾真菌、结核、胞内菌等难破壁的病原体,以及支原体、衣原体、病毒等相对易破壁的病原体。mNGS是无偏倚、无差别的对所有核酸进行测序,每份临床样本中都同时包含宿主核酸与病原核酸,有观点认为需要针对样本中的人源细胞或核酸进行去除,从而提高对微生物的检测敏感性。目前常用的去除人源宿主核酸的方法有:过滤法、甲基化抗体捕获法和选择性裂解法[6-8]。其中过滤法是基于病原体和宿主细胞体积差异进行去除,但由于真核细胞、寄生虫等病原体和人类细胞体积大小近似,过滤法并不太常用。甲基化抗体捕获通过人基因组核酸中广泛存在的甲基化修饰对人的核酸进行去除,但是真菌、寄生虫等真核病原体的核酸同样具有甲基化,会在这一步骤中被去除,因此使用范围受到较大限制。相比之下,选择性裂解的原理是通过人细胞和病原体不同的理化性质,通过温和的变性剂处理优先裂解人细胞(没有细胞壁,较容易破裂),再通过离心富集病原体。选择性裂解法具有方便快捷、微生物损失小等优点,目前被广泛采用。但值得注意的是,某些病原体的理化性质与人细胞相似,比如肺炎链球菌,可能会在去人源的过程中丢失。

目前并没有一套完善的去人源流程,已发表的技术方法都各有优缺点。去人源处理虽然可以提高病原体检测的敏感性,但同时也会显著增加背景微生物的干扰,因此需要对去人源技术进行充分的验证,不建议对所有临床样本都进行去人源处理。

2. 破壁和提取:(1)微生物破壁:mNGS检测灵敏度的关键是对样本内的微生物进行充分的破壁,以释放出核酸。因此实验室需对破壁与核酸提取进行验证,需涵盖难破壁(隐球菌、结核、曲霉)和易破壁(链球菌、病毒等)两大类混合病原微生物。应采用培养后灭活的真实微生物(病毒可以使用假病毒替代)或微生物标准品(中国食品药品检定研究院)。常用的破壁手段有超声破碎和玻璃珠匀质破碎。为了避免样本间的交叉污染,不能使用探头接触式超声仪器。玻璃珠破碎法需要对采购的玻璃珠的容量、粒径大小进行验证。(2)核酸提取:mNGS检测涉及不同的样本类型,实验室应根据待检标本的特点,建立针对性的标准化提取程序,推荐使用经性能验证和确认的商业化提取试剂和设备。针对血浆游离DNA,需采用游离DNA提取试剂,特异性富集血浆中的小片段游离DNA。其他类型样本则使用基因组DNA提取试剂。临床有些样本需进行RNA检测,因此也需对不同试剂和仪器的RNA提取效率进行验证和评估。

3. 文库构建:DNA测序主要涉及两种建库类型:血浆游离DNA和基因组DNA。大部分游离DNA片段在200bp以内,因此无需针对血浆游离DNA进行片段化[9]。基因组DNA在建库时需要进行片段化处理(超声打断或酶切法)。RNA测序则需要进行逆转录步骤,把样本中的RNA分子逆转录成cDNA,在逆转录完成后需要进行片段化处理。(1)文库构建的基本流程包括:DNA片段化、末端补平加A、接头连接、核酸纯化、PCR扩增、核酸纯化[10]。核酸纯化需要有转管操作,建议采用低吸附耗材, 以及尽量避免不必要的核酸纯化步骤,降低转管污染风险,减少核酸损失。为了避免mNGS的假阳性,在建库过程中需要对可能的污染(样本间污染、环境微生物或其核酸的污染)进行监控。如果建库过程包含PCR扩增,需严格遵守临床基因扩增实验室规范。推荐采用核酸纯化步骤少,无PCR扩增环节(PCR-free)的建库方案。(2)自动化文库构建:mNGS对时效性的要求较高,同时对污染又非常敏感,因此建议采用自动化程度高、封闭式建库仪器,尽可能把湿实验流程在封闭的仪器内自动完成。如果建库中需要使用PCR扩增,需严格按照核酸扩增实验室要求在扩增室进行,不建议在建库仪器内进行PCR,否则极易发生气溶胶污染[11]。PCR扩增后的文库不得返回样本制备区,因为核酸纯化需要对PCR扩增后的产物进行开管操作,因此必须在扩增后室进行。如果选用具有PCR功能的NGS自动工作站,建议使用两台完成湿实验流程:一台工作站在样本制备区,完成核酸提取、片段化、补平加A、接头连接、纯化等步骤。文库进入在扩增室进行PCR,扩增产物进入扩增后室,使用另一台NGS工作站完成后续操作。

采用无PCR扩增环节(PCR-free)的建库方案除可规避PCR气溶胶污染和PCR偏好性外,也使NGS自动化全流程可在一台NGS自动工作站完成。实践证明,采用PCR-free建库方案的NGS自动工作站(如杰毅生物NGSmaster)相比手工操作能大幅降低外源微生物污染可能性[12]

三、测序检测技术

1. 测序平台评估:对于采用的测序仪需要从以下几个方面进行综合评估:测序速度、最长读长、错误率、数据通量。测序速度:mNGS检测对于时效性要求高,完成最短50bp读长的测序时间不能长于16小时。最长读长:mNGS具备检测已知微生物,以及未知微生物能力。长读长有利于病原体的基因组拼接,最长读长不应低于100bp。测序错误率:碱基测序错误率要求不高于1%。数据量:目前尚缺乏系统研究不同样本类型需要的测序数据量。国外文献报道集中在6~10M reads左右,国内共识建议采用20M数据量。

2. 测序平台种类:mNGS检测的测序平台主要来自illumina、ThermoFisher及华大基因,以及单分子测序平台Oxford Nanopore。二代测序(以Illumina平台为代表)的测序通量大,每次测序可以产生几千万甚至几十亿条序列,测序错误率低,读长一般在50~300bp之间,目前illumina、华大基因、ThermoFisher等仪器平台已经获得NMPA注册证。单分子测序(或称为三代测序,以Oxford Nanopore平台为代表)的读长长,在菌种鉴定和耐药基因检测相比二代测序具有优势,但测序错误率较高,通量低,直接用于临床样本的宏基因组测序需要去人源或多重PCR建库等微生物富集处理,性能还需充分验证。

3.不同测序平台的测序原理:illumina:可逆末端终止测序法(Sequencing By Synthesis,SBS):采用每次延伸一个碱基,碱基上带有不同荧光颜色以及末端终止基团,测序完成后,会把荧光基团淬灭,并去除终止基团,继续进行下一步测序。illumina平台目前常用的测序平台有NextSeq(NextSeq Dx,NextSeq CN500,NextSeq 550AR),MiSeq Dx,Novaseq,iSeq等平台。 

华大基因:DNA纳米球测序技术(DNBSEQ)通过仪器气液系统先将DNA纳米球(DNA nanoball, DNB)泵入到规则阵列芯片(Patterned Array)并加以固定,然后泵入测序模板及测序试剂。测序模板与芯片上的DNB的接头互补杂交,在DNA聚合酶的催化下,测序模板与测序试剂中的带荧光标记的探针相结合。然后由激光器激发荧光基团发光,不同荧光基团所发射的光信号被相机采集,经过处理后转换成数字信号,传输到计算机进行处理,可以获取待测样本的碱基序列信息。DNBSEQTM测序技术主要包括: DNA单链环化和DNB制备,规则阵列芯片(Patterned Array),DNB加载,cPAS(combinatorial Probe Anchor Synthesis 联合探针锚定聚合测序法), 双端测序技术,以及配合的流体和光学检测技术和碱基识别算法等。cPAS已经广泛地应用于BGISEQ-500,BGISEQ-50,MGISEQ-200,MGISEQ-2000以及DNBSEQ-T7等测序平台。Oxford Nanopore:纳米孔测序(Nanopore)核心DNA建库的时候加上分子马达,将DNA牵引通过电阻膜上的纳米孔蛋白,核酸通过纳米孔的时候会引起电阻膜上电流的变化,通过捕获电流变化来识别碱基。纳米孔测序的特点,读长长,可以到几十kb,病原体鉴定容易,更易做耐药检测,但纳米孔测序缺点是通量低,样本需要进行去人源技术才能进行全面检测。

4. 测序要求:mNGS检测需要涵盖数万种病原体数据库,测序后所得序列和数据库进行对比。因此测序读长不建议短于50bp。读长过短会导致难以鉴定到物种水平。测序数据量应保证每个文库10M reads。在测序时间上,测序时间应不超过15小时,样本处理+测序总时间建议小于24小时。


参考文献

  1. Wilson, M.R., et al., Actionable diagnosis of neuroleptospirosis by next-generation sequencing. N Engl J Med, 2014. 370(25): p. 2408-17.

  2. 华文浩, et al., 生物安全Ⅱ级实验室开展新型冠状病毒检测的风险评估与防控. 中华检验医学杂志, 2020(04): p. 373-374-375-376-377-378.

  3. Quince, C., et al., Shotgun metagenomics, from sampling to analysis. Nat Biotechnol, 2017. 35(9): p. 833-844.

  4. Janda, J.M. and S.L. Abbott, 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. J Clin Microbiol, 2007. 45(9): p. 2761-4.

  5. Anis, E., et al., Evaluation of Targeted Next-Generation Sequencing for Detection of Bovine Pathogens in Clinical Samples. J Clin Microbiol, 2018. 56(7).

  6. Marotz, C.A., et al., Improving saliva shotgun metagenomics by chemical host DNA depletion. Microbiome, 2018. 6(1): p. 42.

  7. Nelson, M.T., et al., Human and Extracellular DNA Depletion for Metagenomic Analysis of Complex Clinical Infection Samples Yields Optimized Viable Microbiome Profiles. Cell Rep, 2019. 26(8): p. 2227-2240 e5.

  8. Charalampous, T., et al., Nanopore metagenomics enables rapid clinical diagnosis of bacterial lower respiratory infection. Nat Biotechnol, 2019. 37(7): p. 783-792.

  9. Shi, J., et al., Size profile of cell-free DNA: A beacon guiding the practice and innovation of clinical testing. Theranostics, 2020. 10(11): p. 4737-4748.

  10. van Dijk, E.L., Y. Jaszczyszyn, and C. Thermes, Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Exp Cell Res, 2014. 322(1): p. 12-20.

  11. Eisenhofer, R., et al., Contamination in Low Microbial Biomass Microbiome Studies: Issues and Recommendations. Trends Microbiol, 2019. 27(2): p. 105-117.

  12. Luan, Y., et al., A proof-of-concept study of an automated solution for clinical metagenomic next-generation sequencing. J Appl Microbiol, 2021.

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