曲霉病实验室诊断新技术与临床应用价值

发布时间:2021-03-17       作者:徐英春       来源:临床实验室        浏览:2381       收藏: 0

作者:张戈   黄晶晶   徐英春

【摘要】免疫功能低下,是导致侵袭性真菌病(invasive fungal disease,IFD)的主要原因,其病原菌以曲霉菌为主。本文就曲霉菌实验室的形态学鉴定的新方法、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的多角度评估,以及血清学、分子生物学和光谱学分析方法的创新应用,概述曲霉菌实验室诊断技术领域的最新研究进展,为临床一线医务工作者提供诊疗思路,为科研人员在该领域的研究方向提供参考。

【关键词】侵袭性真菌病;曲霉菌;实验室诊断

人类免疫缺陷病毒、遗传性免疫缺陷疾病、中性粒细胞减少症、实体器官移植、造血干细胞移植的患者,免疫功能低下,是导致侵袭性真菌病(invasive fungal disease,IFD)的主要原因。尽管发生率低,但发病率和病死率很高[1]。曲霉菌是侵袭性真菌病最主要的丝状真菌病原[2],引发的感染类型主要有侵袭性(急性)曲霉病(IA)、慢性肺曲霉病(CPA)和过敏性支气管肺曲霉病(ABPA)。能否快速进行实验室鉴别和影像学诊断,并使用合适的抗真菌药物,直接决定了患者预后效果[3]。本篇旨在综述曲霉菌实验室诊断技术领域的最新研究进展,为临床一线医务工作者提供诊疗思路。

一、形态学鉴定与鉴别诊断

形态学鉴定,是丝状真菌传统的实验室诊断方法。通过观察菌落的形态、颜色和染色镜检,也可直接进行组织活检,为临床提供诊断依据。但由于部分菌属形态学外观相似,无法准确区分,且依赖于实验室操作人员的经验技术和专业知识,所以鉴定率较低。

为了从常规形态学检测中实现更准确的鉴定,有研究通过无透镜成像系统,将丝状真菌生长过程中的菌落形态捕捉成像,将这些图像收集作为“菌落指纹(colony fingerprints)”。系统提取图像中的菌丝数量、菌丝分枝情况等生长状态,作为计算机判别参数。借助支持向量机(Support Vector Machine, SVM)和随机森林(Random Forest,RF)的机器学习方法,对参数进行处理与分析,48h内即可获取鉴定需要的“菌落指纹”。该研究方法的操作不需要预处理,且成功鉴别了曲霉菌等五种丝状真菌[4]

二、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的应用

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOFMS)目前广泛应用于蛋白质组学、遗传学、药学和微生物学等多个领域[5]。其原理为微量样本通过基质溶剂的辅助,在脉冲激光的作用下解吸电离,通过离子检测器检测离子在真空条件下的飞行时间计算“质核比”,“质核比”数值和信号强度组成完整的质谱图,与数据库进行比对得到鉴定结果。MALDI-TOFMS是快速、准确鉴定细菌和酵母菌的检测方法,且已经广泛应用于临床。培养生长状态良好的菌落是本方法的必要前提,但丝状真菌由于其细胞壁较厚,菌丝和孢子蛋白都会影响检测结果,以及复杂而非标准化的样本前处理,使得高质量的质谱图难以获得,丝状真菌的质谱鉴定现处于科研试验阶段[6]

目前由美国实验室开展的多中心研究,以形态学鉴定和DNA测序结果为参考方法,评价了生物梅里埃公司VitekMS质谱仪(v3.0数据库)的丝状真菌鉴定能力。研究共纳入了1601株临床分离的丝状真菌,有91%株被鉴定到种水平。其中曲霉菌328株,93%株可以鉴定到种水平,准确率较高[7]。有研究者选用布鲁克公司的BrukerAutoFlexTMLTMALDI-TOFMS质谱仪对鉴定丝状真菌的影响因素进行了分析,通过培养基的选择、培养温度、培养时间以及对结果判定截断值(cut-offvalue,COV)这些因素进行分析。研究结果显示,受试菌株在沙堡弱葡萄糖琼脂和土豆葡萄糖琼脂两种培养基间的质谱鉴定率无显著差异,28℃培养条件下的鉴定率高于35℃,培养第2、3天的种水平和属水平鉴定率较高,将质谱仪分析系统种水平判定COV由>2.0下调至>1.7后,受试菌株种水平判定率在不增加错误率的同时,显著提升至85.9%[8]

为了解决培养基琼脂对质谱鉴定丝状真菌的影响,一种新型培养基受到研究者的关注。有研究比较了庆大霉素加氯霉素平板(Sabouraud with gentamicin and chloramphenicol plate,SAB)和ID-真菌板(ID Fungi Plate,IDFP)(Conidia,Quincieux,France),IDFP的特点是渗透膜。在24小时内,渗透膜上的曲霉菌即可以生长出足够进行质谱鉴定所需要的菌丝,且在渗透膜上获取的样本,没有培养基成分的干扰。不仅缩短了培养时间,且提高了鉴定率。但该培养基成本较高,且研究发现在IDFP上菌株传代培养生长良好,但接种临床样本的培养成功率较低,所以是否适用于临床使用有待评估[9, 10]

三、血清学检测

1. 抗原检测:真菌特有的细胞壁结构有90%的成分为多糖,所以对真菌细胞壁多糖的检测成为诊断IFD的重要方向。由于真菌细胞壁在感染期进行着复杂的多糖循环包括(1,3)-β-D葡聚糖(1,3 beta-D-glucan, BDG)和半乳甘露聚糖(galactomannan, GM),甘露聚糖(mannan)和葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖(glucuronoxylomannan,GXM)在内,其含量随感染进程而发生变化[11]

GM通常存在于曲霉、镰刀菌和青霉菌的细胞壁,在曲霉生长时释放,因此可作为曲霉感染的特异性标志物[12],临床实验室主要以血清和肺泡灌洗液作为GM抗原的检测对象[13],目前公认最为敏感的检测方法为酶联免疫吸附法(ELISA)。2016年美国传染病学会(IDSA)曲霉病诊断与治疗指南明确指出GM试验是严重免疫抑制/中性粒细胞缺乏患者IA的有效诊断工具[14]

有回顾性研究显示,GM侧向层析法(GM Lateralflowassay,GM-LFA)在推荐的阳性阈值(GM≥0.5ug/L)时GM侧向层析法的敏感性和特异性分别为96.9%和98%。与GM酶联免疫法一致性89.0%,不一致的结果大部分由于侧向层析法检测结果为阳性,酶联免疫法为假阴性导致。该技术简单、易推广的特点,为GM抗原检测提供了新的方法[15]

2. 抗体检测:曲霉特异性IgG和IgM抗体检测,是针对曲霉感染引起机体产生特异性抗体的检测方法,主要用于非严重免疫抑制/非中性粒细胞缺乏患者IA、CPA、ABPA的有效诊断。2016年美国IDSA指南指出曲霉IgG抗体检测是CPA患者最敏感的微生物学检测方法[14]

有研究显示曲霉特异性IgG抗体诊断CPA的敏感性为84.1%,特异性为89.6%。与肺泡灌洗液样本的GM试验相比敏感性和特异性略高,且多数CPA患者在抗真菌治疗2个月后IgG水平有逐渐降低,这一发现可用于CPA患者的治疗动态监测[16]。IgM的敏感性与特异性则相对有限,与单独使用曲霉特异性IgG试验相比,联合曲霉IgG和IgM试验在诊断CPA方面并没有体现出优势[17, 18]

四、分子生物学检测

基于核酸扩增检测,实验室可以快速准确地从临床样本中检测真菌。CarlosA.Gomez等研究者收集了60例阳性对照和57例阴性对照样本,评估临床样本直接ITS2及D2(真菌保守基因)测序结果,显示直接测序的敏感性、特异性达96.6%和98.2%。研究还收集了116例临床可疑侵袭性真菌病新鲜或石蜡包埋的组织,以及无菌体液样本。依据欧洲癌症研究和治疗组织/侵袭性真菌感染协作组和美国国立变态反应和感染病研究院真菌病研究组(EORTC/MSG)标准,样本直接测序的诊断阳性率为71.3%。诊断成功率依赖于检测的组织含量[19]

28S rRNA区段序列,是曲霉菌高度保守的特异片段。临床可以直接对疑似侵袭性曲霉病患者的支气管肺泡灌洗液进行目的片段检测。有研究纳入了641名患者,根据欧洲临床微生物及感染性疾病及欧洲呼吸道协会(ESCMID/ERS)标准筛选35例侵袭性曲霉菌病患者和13例非侵袭性曲霉病患者,结果显示临床标本PCR检测灵敏度和特异度均较高[20]。除了肺泡灌洗液,脑脊液样本的直接曲霉PCR检测也是临床诊断的有效途径。有回顾性研究纳入72例疑似脑曲霉病患者,88例脑脊液样本。经诊断有12例确诊和疑似确诊的脑曲霉病患者中,真菌培养阳性仅2例,有9例脑脊液曲霉菌PCR阳性,敏感性75%[21]

由于唑类药物广泛应用于人类、畜牧业以及农作物的抗真菌感染治疗,导致唑类耐药烟曲霉(azole-resistant A. fumigatus,ARAf)在临床的分离率升高[22],因ARAf的耐药机制与CYP51A基因启动子中的 TR34/L98H、TR46/Y121F/T289A等位基因突变有关,所以帝国理工学院的研究人员建立芯片诊断平台,并设计了一种快速、定量、特异、灵敏的等温核酸扩增方法,30分钟内完成对突变基因的检测,确认临床和环境中的烟曲霉是否对唑类耐药[23]

五、光谱学分析方法的应用

拉曼光谱是单色光束入射光的光子与分子发生非弹性散射的结果,光谱只与物质自身的分子结构有关,目前该技术已成为生物、医学、化工和材料等领域的重要应用,并延伸发展出如表面增强拉曼光谱、傅里叶红外光谱等光谱分析技术[24]。表面增强拉曼光谱(surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS)以拉曼光谱为基础,拥有更高的灵敏度和特异性。该技术可以检测到单个细胞或单个分子水平,且全细胞SERS指纹图谱具有唯一性,使得SERS在病原体检测、感染分子诊断中占有优势。有研究应用SERS,在新型化学计量学模型:模糊主成分分析(fuzzy principal component analysis,FPCA)结合线性判别式分析(linear discriminant analysis,LDA)的方法下可较清晰的分类鉴别曲霉[25]

在拉曼光谱的检测分析中,常见的影响因素是荧光,而位移差分拉曼光谱(shifted excitation Raman difference spectroscopy,SERDS)可以解决荧光背景的干扰[26]。在曲霉菌的鉴定方向,利用激发波长为785nm的SERDS技术,采集来源于分生孢子细胞壁内的黑色素光谱,选择简易的“神经网络”模型进行物种分类,曲霉分类精度可达到99%,且研究团队公开了研究对象的平均拉曼光谱数据供科研人员下载使用[27]。与拉曼光谱相同,红外光谱也可以反映细胞分子结构。有研究运用傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared,FTIR),结合偏小方差判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)对486株丝状真菌,涵盖43个属,140个种的红外光谱进行采集处理与分析,建立数据库。研究者最终验证该数据库在鉴定丝状真菌的属水平和种水平准确性达99.17%和92.3%[28, 29]

六、总结与展望

在曲霉病的实验室诊断技术中,传统形态学鉴定与鉴别诊断方法虽然敏感性和特异性都非常有限,但实验室工作人员仍应掌握曲霉菌鉴别的基础技能。MALDI-TOFMS虽然以快速和简单的样本前处理、较高参考价值的鉴定结果,获得了更多的关注和研究,但与细菌和酵母样真菌相比,在曲霉菌鉴定领域还有很大的发展空间。血清学检测在曲霉菌感染的病程检测中有着独特优势,仍是临床诊疗不可替代的检测手段。分子生物学的应用,可以直接对疑似曲霉菌感染的病人样本进行检测,更有检测致病菌的耐药基因的优势,快速的帮助患者的诊疗。

研发新型培养基,通过无透镜成像系统捕捉丝状真菌生长过程中的“菌落指纹”,以及光谱学分析方法的应用为科研工作者提供了新的科研方向,有效结合新型化学计量学、“神经网络”模型和机器学习方法等其他学科,可以有效提高曲霉菌的实验室诊断水平,为患者的诊疗提供更多可能。


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