非小细胞肺癌EGFR 基因突变研究的新进展

发布时间:2018-04-01       作者:DDM       来源:临床实验室        浏览:1481       收藏: 0

肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,全世界每年新发肺癌患者大约1,200,000例,在美国每年因肺癌死亡超过15万人,占癌症死亡率的15%。在我国,肺癌已成为恶性肿瘤第1位死亡原因。肺癌是由多种原因引起的一类疾病,按细胞形态大致分为小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC约占20%)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC,约占80%)。而大多数非小细胞肺癌发现时已是晚期,如果不干预不治疗,其诊断后中位生存期仅4-5个月,生存期超过1年的不足10%,虽然传统的手术、放疗及化疗技术水平有所提高,但肺癌的5年生存率仍仅为15%。


EGFR是受体酪氨酸激酶家族成员ErbB家族成员之一,是原癌基因C-erb-1(HER-1)编码表达的产物,该家族包括HER1(erbB1,EGFR)、HER2(erbB2,NEU)、HER3(erbB3)及HER4(erbB4)。


EGFR与其相应配体结合并活化,作为信号转导复合物,进而激活下游信号转导通路引起一系列细胞反应:促进信号传导和细胞生长分化、加速细胞周期进行及促进血管形成,促进肿瘤的生长和转移。


EGFR 基因位于第七号染色体短臂上(7p12),长约118kb,由28 个外显子组成。其转录形成的mRNA长约5.6kb,编码的EGFR是分子量为170 kD的跨膜糖蛋白。编码蛋白由1186个氨基酸组成,具有酪氨酸激酶(tyrosine kinase,TK)活性,是传递胞外信号到胞内的重要途经蛋白。EGFR基因的常见突变位点发生在18、19、20和21号外显子上,其突变可以分为两大类,一个是药物敏感突变,也就是突变后可以使用某种靶向药物(如19缺失,L858R突变);另一个是耐药突变,即突变后对某种靶向药物耐药(如T790M突变)。两种最主要的突变为19外显子缺失(约占45%)和21外显子L858R突变(约占40%),二者均可导致酪氨酸激酶结构域活化,且均为EGFR-TKIs的敏感性突变。肺腺癌患者EGFR基因敏感突变阳性率在高加索人群约为10%,在亚裔人群和我国均为50%左右。


EGFR基因突变的首选标本为石蜡切片标本,当肿瘤组织难以获取时推荐用于晚期NSCLC患者,作为不易获取NSCLC组织样本时的补充手段。如可以获得病理组织时,建议优先考虑病理组织检测结果。


一般推荐用10%中性缓冲甲醛溶液固定组织标本,避免使用含重金属离子的固定液如Bouin液等。甲醛介导的DNA损伤在固定3小时后明显发生,且时间越长,DNA损伤越严重。因此推荐较小的组织(如活检组织标本)固定6~12小时,较大的组织(如手术切除标本)固定6~48小时。用于DNA检测时,需提供10μm厚的石蜡切片4~8张,面积为成人拇指盖大小;活检穿刺标本提供10μm厚切片8~10张。所有切片均为白片。肿瘤组织切片应在HE染色后,经病理医师显微镜下观察,以判断是否含有肿瘤细胞及肿瘤细胞的数量是否足够(一般要求>70%)、坏死组织比例<10%,并在对应的白片上画出癌巢,对肿瘤细胞密集区域进行标注。应采取措施避免核酸交叉污染,制备不同患者病理切片标本时,需更换新刀片。


目前EGFR突变检测的主要方法有:


(1)测序法

目前,DNA测序法是进行EGFR突变检测的可靠方法,也是使用最多的方法。测序法需要对测序样品扩增、纯化、序列分析,过程比较繁琐、耗时长,且对取材和技术要求比较高,更重要的是由于测序方法本身的限制灵敏度不高,只能对含量大于20%的突变基因进行检测,对环境和操作者有危害。虽然有专门的测序公司,可以避免操作的限制,缩短成果时间,但是费用昂贵。因此,此方法在临床应用中还存在一定的限制,不太适于大量临床样品分析。


(2)聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)

PCR-SSCP是一种比较经典的基因突变检测的方法,该方法可以对未知的突变进行检测。单链构象多态性(SSCP)是指单链DNA由于有链内碱基配对而具有一定的空间构象,当碱基发生改变时,单链DNA会形成不同的构象。PCR-SSCP的原理为:在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时,单链DNA迁移率除与DNA长度有关外,更主要取决于DNA单链所形成的空间构象,相同长度的单链DNA因其顺序不同或单个碱基差异,所形成的构象就会不同。PCR产物经变性后进行单链DNA凝胶电泳,有碱基插入、缺失或替代突变的单链就会出现不同的电泳条带。与测序法相比,PCR-SSCP灵敏性更高,操作简单,无需特殊仪器,还可以对未知的突变进行检测。但也有其局限性:电泳时间较长,操作步骤比较繁琐,只能进行定性分析,且需要平行的标准对照,受实验条件影响较大,容易出现假阴性,用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时,突变检出率可达70%-95%,而片段大于400bp时,检出率仅为50%左右。


(3)突变体富集PCR(mutant-enriched PCR)

突变体富集PCR是一种用限制性内切酶选择性消化野生型EGFR基因的两步法PCR。在第一次PCR后选择性消化野生型的EGFR基因,从而使突变的EGFR基因得到富集,然后再进行第二次PCR,最后电泳检测PCR产物,根据PCR产物的性质(大小或有无)来判断EGFR 基因是否发生突变。

与测序法相比,由于突变体富集PCR有两次PCR 扩增,检测EGFR激活突变(外显子19缺失和外显子21 L858R)灵敏性更高,特异性更强,能从103-104个野生型拷贝中检测到一个突变基因。但该方法也存在明显的不足:需要两次PCR,而且需要酶切、操作复杂、耗时长、且容易污染。


(4)扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS)

ARMS又名等位基因特异PCR(allele specific PCR,AS-PCR)。原理为:利用Taq DNA 聚合酶缺少3’→ 5’外切酶活性,PCR引物的3' 端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理,针对不同的已知突变,设计适当的引物以检测出突变基因。该法在设计引物时,在引物3’端设计一错配碱基,一个与野生DNA互补,一个与突变DNA互补,使之仅能与突变型或野生型互补而只扩增突变型或野生型基因。扩增产生的PCR产物可以通过凝胶电泳或是实时荧光定量PCR(real-time PCR)测定进行分析。与电泳检测相比较,荧光定量PCR完全脱离了凝胶电泳技术,避免了有毒操作,自动化程度更高,操作简单,特异性和灵敏性高,重复性好,并且能对突变基因进行定量分析。荧光定量PCR(real-time PCR)是近几年来发展起来的一项新技术,该技术在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现定量功能。原理为:随着PCR反应的进行,PCR产物不断累积,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,荧光定量PCR仪收集一次荧光信号,这样我们就可以借助于荧光信号强度来监测PCR产物的变化。

蝎形探针扩增阻滞突变系统(Scorpions ARMS)是将ARMS和 Scorpions实时PCR 技术相结合的一种新技术。该技术所用探针为Scorpion探针。Scorpion探针是一种新型的探针,由一条发夹结构的探针和一条引物构成,探针的5’端和3’端分别标有报告荧光和淬灭荧光,3’端通过PCR blocker(一个非扩增的单体,防止探针退火后的延伸)与引物的5’端相连。在自由状态,报告荧光和淬灭荧光很接近,不产生荧光。变性阶段茎环结构打开,退火时引物与模板结合并延伸,环区与新合成的目的基因的互补区域结合,此时Scorpion探针与PCR产物在同一条DNA链上,是分子内的结合。由于发夹结构打开,报告荧光和淬灭荧光分离,因此可检测到报告荧光发出的荧光信号(如下图)。由于Scorpion探针中序列特异性引物和探针在同一分子上,因此信号的产生特别快。

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(5)数字PCR(digital PCR)

微数字PCR被称作是一种改变生物医学面貌的新技术,在基因芯片技术基础上发展出来。数字PCR的原理为:将样品作大倍数稀释和细分,直至每个细分试样中所含有的待测分子数不会超过1个,再将每个细分试样同时在相同条件下PCR后通过基因芯片逐个计数。数字PCR是一种绝对定量的方法。微数字PCR是集成流路芯片为基础的数字PCR技术。该技术很容易实现单个分子的检测,测量准确度达99%以上。芯片进样和加试剂都在芯片上通过计算机控制,利用专门设计的流路和阀门在密闭环境下自动完成,最后计数由计算机完成。


微数字PCR灵敏度和准确度更高,大大减少了人工操作。由于芯片在PCR之前密封,有效避免了交叉污染。操作时间短,可在2个小时内(仅需20分钟的人工操作时间)完成12个样品的同步检测,无需采用标准进行校准。虽然微数字PCR具有无可比拟的优越性,但应用于临床EGFR突变检测还需要更多的努力。


(6)高分辨率溶解曲线分析技术(high resolution melting analysis,HRM)

HRM利用不同长度或不同碱基组成的DNA序列溶解曲线不同的原理,在PCR后直接运行高分辨溶解就可完成对样品突变分析。通过大样本的HRM分析证实HRM是一种灵敏度为100%的EGFR基因突变筛选技术,可用于体细胞突变的检测和测序前突变的筛选。该方法无需序列特异性探针,也不受突变碱基位点与类型的局限,应用Roche LightCycler 480 等荧光定量PCR仪器分析,即可完成对样品基因型的判断,操作简单,无需PCR后续操作,选择性好。但该方法也有其局限性:只能分析纯度单一的小片段DNA,且要求有足够的PCR 模板,模板含量不少于1 ng时能得到稳定可靠的结果。


(7)高效液相色谱法(denaturing high-performance liquid chromatograph,DHPLC)

DHPLC又称为温度调控高效液相色谱(temperature-modulated high-performance liquid chromatography, Tm-HPLC)。DHPLC能以3 种方式操作:①在不变性温度条件下,可分离分子量不同的双链DNA分子或分析具有长度多态性的片段,类似RFLP 分析。②在充分变性温度条件下,单链DNA或RNA 分子能被区分,适用于寡核苷酸探针合成纯度分析和质量控制。③在部分变性的温度条件下,可进行基因突变检测、SNPs。DHPLC技术的原理是基于发生错配的杂合双链DNA与完全匹配的纯合双链DNA解链特征的差异将它们分离开来。由于杂合双链DNA错配位点处氢键被破坏而形成“鼓泡”,在部分加热变性的条件下,更易于解链形成Y 形结构,与固定相的结合能力降低,所以杂合双链将先于纯合双链被洗脱出来,通过洗脱峰的不同就可判断是否有突变存在。DHPLC可检测出含有单个碱基的置换、插入或缺失的异源双链片段。缺失或插入突变非变性方法和部分变性方法都能较好地检测出来,但利用非变性方法的检测结果中,野生型和突变型的区别更容易判断。


与DNA测序法相比,DHPLC简单、快速(三分钟就可完成一个样本的检测),不仅可用于已知突变的检测,还可以用于未知突变的扫描。DHPLC也有其不足:不能检测出同源突变,只能检测有无突变,且不能检测出突变类型;结果判读容易出错,且当有多个片段需要检测时,由于有多个解链温度,需要多步检测,增加了工作量等。

近年来,部分病人组织标本的获取存在困难,液态活检迅猛发展。液体活检技术是指对血液等体液标本进行诊断分析,其具有取样便捷、微创、便于实现动态监测、能更完整的反应肿瘤基因信息、克服单一病灶取样的空间限制等优势。其中,检测血液ctDNA是目前液体活检领域发展最快的检测方法。 


一、血液ctDNA-EGFR标准化检测三个关键环节

非小细胞肺癌临床实践中肿瘤组织检测目前尚有种种局限,探寻作为其补充或替代的其他生物标本进行EGFR基因检测具有重要临床意义,也有助于提高临床患者的总体EGFR基因受检率。近年来以血液等为样本基础的液体活检技术飞速发展。研究表明,当肿瘤组织难以获取时,无创、易采集的血液检测是组织EGFR基因突变分析合适的替代选择,并且血液检测在一定程度上能有效克服肿瘤异质性,可实现无创实时动态检测等。而标准化的检测流程是保障ctDNA-EGFR血液检测质量的前提,临床专家对于血液检测应用规范问题也多有探讨。其中,标本采集及处理、cfDNA的提取、EGFR突变检测是血液检测的三个重要环节。


1、标本采集及处理

(1)患者选择:研究显示,肿瘤分期越高,ctDNA检出率越高,即III或IV期的肿瘤患者血液中的ctDNA相较Ⅰ/Ⅱ期的患者含量更高,更容易被检出。因此,为提高血液EGFR检出率,建议选择晚期患者。

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药物治疗过程中,EGFR突变情况以及ctDNA的浓度可能发生变化。如图:

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(2)标本采集及分离:全血中血浆和血清均能分离出ctDNA,但研究显示,相对于血清标本,血浆中ctDNA有更高的检出率。另外,对同一患者,血浆量越多所提取的DNA量就越多,其中含有的cfDNA量就越多,对检测越有利。

因此按照专家共识建议采集10ml全血(可分离4-5ml血浆),采集完成后需缓慢颠倒混匀,以便于抗凝剂或保护剂充分与血液接触。

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此时需根据使用的采血管类型(常规EDTA抗凝管/专用常温采血管)进行不同的后续操作:

1)用常规EDTA抗凝管采集全血后,为防止游离DNA的降解,避免野生型DNA背景的增加,建议两小时内以足够的离心力将全血充分低温离心两次,分离出不含细胞成分的血浆,吸取操作如下图所示,分离出的血浆放置于-70℃冻存直至DNA抽提,或直接进入DNA抽提步骤(备注:离心前临时保存应暂放于2~8℃冷藏);

2)用含有游离DNA保护剂及防细胞裂解保护剂的专用常温采血管采集后轻摇混匀,常温放置不超过5-7天,以足够的离心力将全血充分离心两次,分离出不含细胞成分的血浆,放置于-70℃冻存直至DNA抽提,或直接进入DNA抽提步骤。如果外送运输全血,建议使用cfDNA专用常温采血管;

禁用肝素抗凝管:由于肝素使得DNA抽提率降低并在DNA提取过程中难以去除,也会导致PCR效率降低,因此cfDNA检测血液采集禁用肝素抗凝管。

(3)血浆质量评价

1)血浆是否溶血:如发生严重溶血,标本不可用,血红蛋白及其代谢产物可能抑制Taq酶活性,使PCR扩增效率明显降低;

2)血脂是否过高:血脂过高,使血浆呈乳白色,低密度脂蛋白对荧光有屏蔽和吸收作用,故对PCR有干扰。


2、cfDNA提取

10ml全血分离出的4-5ml血浆用于cfDNA的提取。目前可用于cfDNA提取的方法很多,有实验室自建方法,也有商用核酸提取试剂盒。建议采用国家药监部门批准的、大容量血浆游离DNA分离试剂盒。所提取的cfDNA建议马上使用,若不能立即进行后续检测而需要储存cfDNA,首选-80℃冰箱冻存;若无-80℃冰箱,可选择-20℃保存,应尽可能缩短冻存时间,尽快进行后续检测;冻存时注意密封及标记完整,避免反复冻融。


3、基因突变检测

前国家食品药品监督管理总局(CFDA)在2015年2月批准吉非替尼说明书更新,可通过血液ctDNA检测EGFR基因突变指导吉非替尼治疗。近期CFDA更是通过创新医疗器械特别审批的方式,快速批准艾德生物自主创新产品Super-ARMS® EGFR检测试剂盒(Super-ARMS技术是在原有ADx-ARMS技术优势基础上,优化引物探针设计和反应体系,将检测灵敏度提升至0.2%,完全适用于对灵敏度要求更高的血液检测领域)用于血液ctDNA-EGFR基因突变的检测。


为了降低假阳性概率,推荐使用经国家药监部门批准的高敏感度的检测方法用于ctDNA样本的EGFR基因突变检测。专家共识中也指出,检测必须在具有资质的检测中心进行。检测方法必须进行严格的验证及质控。检测试剂须使用经CFDA批准的检测试剂盒。目前,检测基因突变最常用的方法是扩增阻遏突变系统(ARMS法),欧盟批准用于指导吉非替尼治疗的血液检测方法也是ARMS检测方法。而Super-ARMS®方法是CFDA批准用于血浆中EGFR突变检测的敏感度最高的ARMS方法,其检测灵敏度可达0.2%。


根据今年ESMO(欧洲临床肿瘤协会年会)大会上,上海肺科医院周彩存教授、广东省人民医院吴一龙教授等多位肺癌权威专家共同发布的AURA 17扩展研究数据可知,Super-ARMS®技术检测血浆T790M突变的阳性检出率仅次于目前灵敏度最高的ddPCR技术。更重要的是,Super-ARMS®技术检出的血液T790M突变阳性患者奥希替尼的客观响应率(ORR)最高,高达64%,说明灵敏度0.2%的Super-ARMS®技术是临床血液ctDNA检测的最优选择,疗效预测的准确性最高,是血液检测临床应用的可靠技术。

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二、几种外周血的EGFR突变检测方法介绍

目前外周血的EGFR突变检测方法主要有罗氏诊断cobas,Taqman-ARMS,Bio-rad微滴式数字PCR,BEAMing数字PCR和二代测序(NGS)等,以下分别做简单介绍:


罗氏诊断cobas

cobas® EGFR Mutation Test v2,这是一款以血液为基础的、用于特罗凯的伴随诊断试剂盒。这是一种多重qPCR检测,能够扫描ctDNA或组织来源的DNA,定性检测EGFR基因上七个位点的42种不同突变。


Taqman-ARMS

ARMS法即扩增阻滞突变系统,也称等位基因特异性PCR。用PCR对突变基因进行检测时,只有与突变DNA完全互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。该方法先通过等位基因特异性引物将DNA突变点富集;然后用设计的TaqMan荧光探针将富集的DNA突变点通过荧光信号的积累检测出来。


Bio-Rad微滴式数字PCR

微滴式数字PCR系统在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理,即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴,其中每个微滴或不含待检核酸靶分子,或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后,逐个对每个微滴进行检测,有荧光信号的微滴判读为1,没有荧光信号的微滴判读为0,根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。


BEAMing数字PCR

BEAMing数字PCR检测是结合了磁珠法乳浊液扩增和流式细胞术的一项技术,灵敏性高,而且能对肿瘤DNA分子突变进行定量。


二代测序平台

NGS技术平台可并行检测成百上千的基因,可检测原发肿瘤、转移灶甚至外周血中游离的肿瘤DNA(ctDNA)和RNA。相对于传统的Sanger测序法,NGS法避免了克隆过程,直接使用接头进行并行PCR(聚合酶链反应)、测序反应,因此其数据通量得到大幅提高,可以在更短的时间内对更多的DNA进行测序。


微滴数字PCR法和BEAMing数字PCR法比ARMS法和cobas法具有更高的敏感性,但特异性稍差。以上四种方法仅检测已知的基因突变。NGS技术可以进行全基因组范围内的基因变异分析,包括基因突变、重排以及扩增。然而由于缺乏标准化的检测流程,在样本处理、测序深度和数据分析方面的差异导致结果的重复性欠佳。今年ASCO会议报道了使用三种检测方法对CO-1686临床的患者组织(Qiagen NGS)、血液(BEAMing法)以及尿液标本(Trovagene NGS)进行EGFRT 790M突变检测。结果显示:血浆检测T790M突变与组织T790M的一致率为81.5%,尿液检测的T790M突变与组织检测的一致率为83.8%。


三、Digital PCR在EGFR的T790M突变检测中的应用

亚洲人群中非小细胞肺癌患者约有50%携带EGFR突变,而针对不同的EGFR突变也有不同的TKIs可以用于治疗。2017年3月24日,阿斯利康宣布“AZD9291”(奥希替尼)已获得中国药监局批准上市,其正式中文名为“泰瑞莎”,对于“泰瑞莎”的伴随诊断检测试剂的开发也如火如荼地开展起来。与一代TKIs不同,“泰瑞莎”的靶点单一。基于此单一检测的需求,“digital PCR”由于其灵敏度高、操作简单、结果直观的特点而进入了开发者的眼帘。目前各伴随诊断试剂的开发者也争分夺秒的进行digital PCR仪器及T790M检测试剂盒的注册。数字 PCR采用了与传统实时荧光定量PCR相同的引物组、荧光标记物和酶试剂进行反应构成。但在数字PCR中,样本被分到数万个单独的 PCR 反应中——形成有限稀释。与实时荧光定量PCR不同,数字PCR提供了一种高度精确且灵敏的方法,无需参考样本或标准曲线即可得到待检测目标位点的绝对含量。以Thermo Fisher的QuantStudio™ 3D数字PCR系统为例,利用基于芯片的技术,将一个标准的 PCR 反应混合物分成 20,000个单独的PCR 反应。这种直接的样本稀释过程可以使众多反应中的一部分反应含有目标分子,另一部分则不含有目标分子,分别代表阳性和阴性反应。经PCR扩增后,对样本中的目标分子数进行绝对计数,无需参照标准品或对照品。进行T790M检测时,可以精确的得到十几个到几十个copies/ul的准确含量。

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数字PCR基本操作步骤


对于T790M“Digital PCR”就够了吗? 

AURA(旨在研究奥希替尼治疗后血浆EGFR突变水平的动态变化是否与临床疗效相关)I期临床研究中,143例(T790M)阳性患者在基线时检测到EGFR突变;对于143例可检测的EGFR突变(Ex19del、L858R和T790M)患者,中位基线等位基因突变频率分为7.09%(0.05-75.3)、3.81%(0.04-79.5)和2.12%(0.06-41.6);在92/143(64%)患者中观察到治疗6周时血浆EGFR突变的清除;与治疗6周后可检测到血浆EGFR突变的患者相比,血浆EGFR突变清除的患者中位PFS明显更长(10.8个月vs4.2个月;95%CI分别为9.3-12.7和4.1-6.8)。


在治疗开始后6周内存在或不存在血浆EGFR突变,可潜在用于预测奥希替尼治疗的疗效。研究中利用数字PCR方法分析血浆中是否存在EGFR的突变。但由于数字PCR系统荧光通道的限制(FAM、VIC、ROX),每个样本只可进行单位点的检测,对于一个样本Ex19del、L858R和T790M需要进行3个反应的检测方可实现。


对于EGFR突变,只有T790M就够了吗?

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PET-CT扫描:奥希替尼治疗后病灶变化;

肝病灶(红色箭头,T790M突变阴性)无明显疗效

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随治疗方案的改变,不同cfDNA测序EGFR基因突变谱

 

2017年2月Peled教授在JTO上报道了一例特殊的IIIA期肺腺癌患者,随着疾病的进展及治疗过程的推进,出现了多种EGFR突变。患者2013年10月诊断为III期肺腺癌,接受了放化疗治疗。2014年4月脑、肝、骨转移,PCR发现EGFR基因19外显子缺失,吉非替尼治疗。2015年3月,经血浆cfDNA全外显子测序,EGFR 19外显子缺失(MAF19.5%),T790M(6.5%),G724S(2.9%),奥希替尼治疗。肝病灶组织标本测序显示EGFR扩增,19外显子、G724S突变、T790M突变阴性。奥希替尼治疗期间,T790M克隆消失,G724S占主导地位,采用奥希替尼+阿法替尼治疗。血浆cfDNA测序显示G724S突变由33.7%下降至0.3%。肝病灶持续进展,再次cfDNA测序,结果出现C797S(0.1%)对奥希替尼耐药,同时其他突变如G724S等都有所增长。采用培美曲塞化疗,再次cfDNA测序显示C797S和G724S突变均显著下降,但总cfDNA增加、且无明显临床获益。


在治疗过程中,随着药物的选择压力,不断有EGFR新突变的发生,也不断有原有EGFR突变的消失,显示了EGFR驱动突变肺癌诊疗的复杂性。且由于肿瘤亚克隆的突变和异质性,采用血浆cfDNA测序检测的方法更能全面囊括不同时期的不同突变。

 

JTO另外发表了一项广东省人民医院关于“一代和三代TKI联合用药有效治疗携带EGFR-T790M和反式C797S基因突变的腺癌患者”的研究成果如下:


临床诊断:右下肺中央型腺癌cT4N1M1b,IV期,EGFR突变

治疗过程:患者入组阿法替尼临床实验,用药一个月后PR。(partial remission 部分缓解)

12.8个月后疾病进展,显示携带EGFR 19del突变和T790M耐药突变。采用奥希替尼治疗后PR,7.4个月后再次疾病进展。血浆cfDNA进行NGS检测,显示携带EGFR 19del,T790M,C797S三种突变。且T790M、C797S呈反式存在(T790M与C797S突变位于不同的等位基因上)。患者接受厄洛替尼+奥希替尼治疗,症状明显缓解。一个月后cfDNA检测C797S消失;两个月后cfDNA检测T790M消失。治疗进行三个月后,cfDNA测序显示,EGFR 19 del,T790M,C797S突变再次出现,且T790M与C797S突变呈顺式(T790M与C797S突变存在于同一条等位基因上)。患者接受艾维替尼治疗,无临床获益,停药。随后接受紫杉醇联合贝伐单抗治疗,临床症状缓解。此患者随着治疗过程,出现EGFR 19 del、T790M与C797S反式,T790M与C797S顺式突变。该患者在病情进展阶段,T790M与C797S从反式到顺式的转变可能是一个潜在的耐药机制,也提示顺式C797S突变克隆成为推动疾病进展的主要克隆。

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EGFR突变丰度

(A)奥希替尼耐药后

(B)厄洛替尼+奥希替尼联合用药 ,患者PR

(C)患者再次PD

 

对于T790M与C797S呈反式或顺式存在,在NGS结果中可以通过两种突变是否出现在同一条reads而判断,而其他的检测方法就显得有些力不从心了。对于如此变化的EGFR,对于某一种药物的动态检测,采用“Digital  PCR”不失为一种经济快速的好选择。而从整个疾病过程管理角度看,NGS可能更加全面有效。


四、EGFR突变丰度的定义、检测和应用

大多数NSCLC在诊断时即处于进展期,对于具有敏感突变基因的患者来说,靶向治疗为其标准治疗。多项研究证实具有表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)敏感突变的患者对酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors, TKIs)具有良好反应,总反应率为55%-80%,无进展生存期(progression-free survival,PFS)为9-14个月。但是,即使具有相同类型乃至相同亚型,不同患者对TKIs的反应也不一致。之前研究发现,肿瘤组织的分子异常存在异质性,即同一肿瘤中同时含有EGFR突变和野生型克隆,因此推测突变分子含量的不同是TKIs反应不一的部分原因,具有更高EGFR突变“丰度”的肿瘤患者可能从TKIs中获益更多,仅仅定性分析突变来指导靶向治疗已不能满足临床需求。随着数字PCR(digital PCR,dPCR)、二代测序(next generation sequencing,NGS)等方法的出现,定量检测EGFR突变已经成为可能。但是,EGFR突变丰度尚无统一定义,其与突变型肺癌及TKIs疗效的关系也并无定论。现将目前EGFR突变丰度的含义及其临床意义综述如下:


1、EGFR突变丰度的定义及检测方法

丰度(abundance)概念来自于化学,最初指元素的相对含量。而肿瘤学中所谓EGFR基因突变的分子丰度还没有统一的定义和标准,一般指突变型EGFR突变基因相对或绝对定量值,丰度的概念也随检测方法和检测样本的不同而各有不同。


(1)EGFR突变丰度的定量检测

随着突变定量检测方法的出现,更多研究使用EGFR突变和野生型拷贝的比值来定义丰度。2009年,Yung等第一次使用丰度概念并用dPCR将EGFR突变定量化。研究使用微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)方法来定量NSCLC患者血浆和肿瘤组织的EGFR常见突变(19外显子缺失和L858R点突变)。ddPCR敏感性高,可检测到临床样本的单个突变DNA分子,并准确测定突变及野生序列的数量。作者发现检测到的比例浓度可低至0.1%,并将丰度定义为突变分子数在总的DNA中所占浓度。研究发现突变患者接受TKI治疗后出现EGFR突变丰度的下降,但没有分析基线突变丰度和疗效预测及预后价值。


Wang等使用纳流控ddPCR分析平台(nanofluidic digital PCR assay platform),通过计算EGFR分子和单拷贝基因RPP30数量的比值来确定基因组DNA拷贝中含有多少突变分子,也即EGFR基因拷贝的相对数。此种方法检测下限可低至0.02%,检测到20个手术切除样本的EGFR突变丰度为0.02%-9.26%。


Marchetti等使用半定量指数(semiquantitative index,SQI)定量EGFR突变。SQI来自包含突变EGFR和固定量野生型EGFR的已知拷贝数稀释系列,并以qPCR中野生型DNA作为内参,反映EGFR突变基因对比野生型拷贝数的趋势。研究检测了69例EGFR突变肿瘤和21例阴性对照患者的血浆,发现SQI和厄洛替尼治疗后反应相关。


Yang等的研究使用ddPCR方法定量和动态检测循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)的EGFR突变,发现ddPCR检测的下限是0.04%。以肿瘤组织的EGFR突变为金标准,血浆ctDNA的一致率为74%(54/73)。ddPCR检测循环EGFR突变等位基因和野生型等位基因的绝对量,突变EGFR ctDNA和野生型ctDNA的浓度比值定义为EGFR突变丰度。其中,54例未治疗突变患者血浆中中位绝对和相对EGFR突变等位基因量是487拷贝/反应和5.15%,因此,研究将相对EGFR突变量>5.15%者定义为高丰度(n=27),而≤5.15%者为低丰度(n=27)。


关于厄洛替尼和化疗间插治疗的FASTACT-2研究前瞻性用cobas检测基线、第3周期和疾病进展(progressive disease,PD)的血液标本,检测血浆游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)EGFR突变状态,并使用突变拷贝数/血浆毫升数定量监测TKIs治疗过程中动态变化。但此丰度定义方法可能容易受到非肿瘤DNA数量等影响,是否准确还需要进一步验证。


NGS同样可用来检测突变丰度。2016年,Zhang等使用单分子扩增和再测序技术(single-molecule amplification and resequencing technology,SMART)行基因检测,将突变率定义为突变等位基因数量/总等位基因数量。以ARMS作为标准,SMART的敏感性和特异性分别是98.7%和99.0%。但研究并未发现丰度和使用TKIs的PFS之间具有相关性。


由于对一代TKIs耐药机制的深入理解和三代TKIs的出现,T790M定量检测的重要性也逐渐被认识到。有研究将T790M等位基因数量对比活化突变等位基因数量进行T790M相对定量,使用磁珠乳液扩增PCR(bead, emulsion,amplification,magnetic,BEAMing)检测23例TKIs后PD患者和21例突变未经治患者的ctDNA,发现T790M比活化突变值为13.3%-94.0%。检出率在PD患者中更高,两组分别是82.6%和61.9%(P=0.18)。还有研究使用相同定量方法检测T790M及活化突变在TKIs治疗前后变化,使用ddPCR检测TKIs治疗前后肿瘤组织。三代TKIs药物rociletinib的I期/II期研究对PD患者进行活检,同样检测T790M对活化突变等位基因的相对频率。


有研究使用ddPCR检测cfDNA EGFR T790M,以突变T790M/(突变T790M+野生型等位基因)比值进行定量,并以5%和0为界进行高/低/无分组,研究其基线值和TKIs反应关系,及动态变化和疗效关系。同样地,上文提到的SMART技术也可定量检测T790突变,将突变率定义为突变等位基因数量/总等位基因数量,用ARMS和SMART测得T790M突变率分别是1.1%和2.2%。三代TKI奥希替尼的临床研究同样使用NGS来检测T790M丰度和疗效的相关性。


(2)蛋白检测

由于DNA测序的敏感性依赖于肿瘤细胞在样本中的比例,特别是依赖于携带突变的肿瘤细胞百分比。因此,有研究发现针对两个最常见EGFR突变的特异性单克隆抗体,用Western blot、免疫荧光、免疫组化(immunohistochemistry,IHC)检测340例NSCLC患者的组织突变,和直接及以质谱为基础的DNA测序方法相比,敏感性为92%,特异性为99%。不同于DNA测序,IHC的结果依赖于单个肿瘤细胞染色的强度,而不是整个肿瘤裂解物。因此,肿瘤样本突变如果有低百分比的EGFR突变肿瘤细胞,DNA测序可能难以测出,但能被IHC突变特异性抗体检测到,尤其是在小样本标本具有优势。此外,IHC也较少受到癌细胞空间分布的影响。但抗体只针对EGFR的特定常见突变,其他突变无法测出。


之后有研究使用IHC定量检测47例PCR证实突变的NSCLC患者,表达分数由染色强度和表达突变EGFR肿瘤组织的比例共同决定。表达EGFR突变的肿瘤细胞比例(比例分数):0:无;1分:1%-10%;2分:11%-30%;3分:31%-50%;4分:51%-70%;5分:71%-100%。染色强度(强度分数):>10%的肿瘤细胞中,0:不染色;1分:弱染色;2分:中度染色;3分:强染色。总表达分数为二者相加。19外显子缺失和L858R突变的中位分数分别是4分和7分,因此将19外显子缺失定量为:0分-3分:低表达,4分-8分:高表达;L858R定量为:0分-6分:低表达,7分-8分:高表达。


2、EGFR突变丰度的临床意义

(1)反映肿瘤异质性

有研究使用qPCR检测突变比。如上文定量方法所述,突变比=突变水平/(突变水平+野生等位基因水平)。检测50例NSCLC患者的原发灶和转移灶,原发灶不同部位的定量平均突变偏差是18.3%(范围0-54.3%),具有高水平一致性。而转移灶肿瘤EGFR突变比显著低于原发灶,Kappa值是0.615(P<0.01)。这一研究说明尽管为同一来源肿瘤,原发灶和转移灶的突变丰度也具有异质性,也可以解释在TKIs治疗过程中,不同病灶反应不一。


(2)突变丰度与疾病转归

Yung的研究中,突变序列的血浆浓度和临床反应一致性良好。所有部分缓解(partial remission,PR)和完全缓解(complete remission,CR)的患者浓度降低,而PD患者突变持续。其中一个患者初始反应后因药物不良反应停用TKI,停药后4周肿瘤相关EGFR突变再次出现,证明EGFR丰度变化可反映疾病动态变化,但研究未阐述基线丰度水平和疗效之间的关系。


TKIs治疗过程中血浆EGFR突变动态定量改变和临床结局的关系还不清楚。III期随机对照研究CTONG0901探索性分析了血浆EGFR L858R突变和TKIs反应及耐药的关系。使用qPCR检测80例患者血浆的相对L858R拷贝数,发现在对TKI反应最好时L858R量最低。和基础L858R量相比,进展时量增加超过一倍作为分界,61例患者进展时L858R增长到最高水平(上升型),19例患者进展时稳定不变(稳定型),上升型的PFS长于稳定性,两组的中位PFS分别是11.1个月和7.5个月。但此种方法为回溯性分析,缺乏疗效预测价值。


(3)突变丰度预测TKIs疗效

初治患者的基线EGFR丰度似可预测TKIs疗效。Zhou等的半定量丰度研究中,100个月接受检测的患者中51个月为高丰度,18个月为低丰度,接受吉非替尼治疗后,PFS分别是11.3个月和6.9个月(P=0.014),说明基线的相对EGFR突变丰度可以预测TKI获益程度。但Chiu等发现高低丰度患者对TKI反应没有显著不同,直接测序和ARMS法检测突变结果不同和相同患者的PFS分别是13.4和 10.9个月,没有显著统计学差异。但Zhou的研究和Chiu的研究不同之处在于,前者只纳入肿瘤细胞超过50%的样本,而后者大约60%的标本肿瘤细胞小于50%,不能除外肿瘤细胞比例对直接测序突变检测的影响。


吉非替尼治疗患者使用IHC进行EGFR突变定量,高分比低分的PFS显著延长,分别是12.2个月和3.4个月(P<0.001),证实肿瘤组织EGFR突变表达的定量分析可预测TKIs疗效。


同样,丰度动态变化也可反映TKIs疗效。血浆EGFR突变快速降低预示更好的TKIs反应。FASTACT-2研究,EGFR突变特异性cfDNA水平在第3周期降低,进展时升高。第3周期时血浆EGFR突变依旧阳性预示较差的临床结局。


Yang的研究发现,同为肿瘤组织突变阳性患者,和血浆野生型(n=19)相比,ctDNA突变的患者(n=54)具有更好的PFS(12.6个月 vs 6.7个月,P<0.001)和OS(35.6个月 vs 23.8个月,P=0.028)。和低EGFR丰度(≤5.15%)患者相比,高EGFR突变丰度患者(>5.15%)具有更好的PFS(15.4个月 vs 11.1个月,P=0.021)。分析67例进展后患者血浆DNA,43.3%患者出现丰度降低,19.4%不变,37.3%升高。降低组具有更好的PFS(12.7个月 vs 7.1个月,P=0.001)和OS(28.3个月 vs 14.9个月,P=0.027)。T790M的出现和丰度变化趋势无关。


FASTACT-2研究中,总的EGFR突变特异性cfDNA水平在第3周期降低,在PD时回归。和化疗+安慰剂组对比,在第3周期和PD时化疗+厄洛替尼治疗组突变EGFR等位基因数量更少(第3周期:5拷贝/mL vs 0;PD:83拷贝/mL vs 6拷贝/mL)。厄洛替尼组第3周期仍可检测到突变EGFR等位基因的患者PD风险增加62%,死亡风险增加55%,因此,第3周期时的cfDNA EGFR突变阳性是更差PFS和OS的预测因子。


另有研究分析9例TKIs PD患者,所有患者接受厄洛替尼治疗后都出现血浆EGFR突变丰度降低,其中8例患者达到血浆CR,1例没有出现血浆CR的患者则出现了早期进展。6例患者在客观进展时血浆中又检测到了突变EGFR,血浆PD出现在RECIST进展前4周-12周。


使用SQI半定量检测血浆EGFR突变,TKIs治疗后的4d-60d系列EGFR检测出现进行性SQI下降。经过TKIs4d治疗后,SQI平均降低13.5%,8d降低41.6%,14d降低63.5%。除了2例患者,在8d-60d后血浆检测都为阴性。70%患者(快速反应者)在14d时下降超过50%,另外30%的患者(缓慢反应者)在14d时下降小于50%。2个月时SQI的降低率和肿瘤缩小比例(percentage of tumor shrinkage,PTS)显著相关,快速反应者PTS平均降低(59.1±1.8),缓慢反应者则降低(18.3±3.7)(P<0.0001)。2例慢反应者EGFR突变没有完全清除,在35d时T790M就意外出现,之后进一步增长,这些病例被定义为早期耐药。因此,连续检测血浆基因型可能是反映靶向治疗疗效的良好临床分子标志,也是潜在的早期临床试验终点。


有研究探索了突变丰度和再使用TKIs的关系。检测51例TKIs获得性耐药患者,使用qPCR检测突变,EGFR突变丰度=突变EGFR量/(突变量+野生量)。51例突变NSCLC患者的中位丰度是0.501,5,因此将丰度≥0.501,5高丰度(H),<0.501,5为低丰度(L)。和L组相比(27/51),H组患者(24/51)再次使用一代TKIs具有显著延长的PFS(5.27个月 vs 2.53个月,P=0.033)。因此,使用一代TKIs耐药后,具有更高突变EGFR丰度是接受TKIs再治疗的潜在指标,可能是因为依赖于EGFR信号通路的肿瘤细胞比例更高。


(4)T790M突变丰度的临床意义

T790M突变丰度的增加可能和一代TKIs耐药具有相关性。有研究使用ddPCR检测到所有25个组织中T790M(治疗前13个样本,治疗后12个样本),计算活化突变(L858R)或T790M等位基因和对照等位基因数量比值。用药前L858R/对照=65.62%,T790M/对照=0.34%,T790M等位基因和活化突变等位基因数量比(T/A)=0.52%。用药后L858R/对照=3.87%,T790M/对照=1.89%,T/A=48.84%。10例低T/A比值,TKIs治疗显著肿瘤退缩。其中6例耐药患者T/A出现显著增加。因此,一代TKIs治疗过程中,T790M丰度的增加可能提示出现获得性耐药。


但也有研究得出不同结论。有研究用ddPCR检测TKIs治疗前后血浆cf-DNA T790M的变化,发现TKIs治疗前T790M阳性患者具有更差的PFS(8.9个月vs 12.1个月,P=0.007)和OS(19.3个月 vs 31.9个月,P=0.001),而基线高丰度(>5%)T790M预示着更差的PFS(7.1个月vs 9.5个月,P=0.001)。但在TKIs治疗过程中,T790M数量增加者反而具有更优PFS(11.6个月 vs 7.1个月,P=0.044)和OS(26.3个月 vs 19.3个月,P=0.015)。是否天然和获得性T790M的临床意义不同还需要进一步探索。


治疗前T790M阳性细胞比例可预示对T790M阳性肿瘤对三代TKIs rociletinib的治疗反应。25例接受rociletinib治疗的患者,基线T790M阳性细胞比例更高者,rociletinib治疗后具有更大的肿瘤缩小,说明T790M负荷定量信息可提示患者治疗反应,肿瘤中定量等位基因频率是预测最大获益的指标。同样,奥希替尼的I期AURA研究的事后分析以相对等位基因比例(allelic fraction,AF),也即EGFR突变cfDNA和野生型EGFR cfDNA的比值进行突变定量,发现cfDNA T790M突变阳性患者,组织T790M阳性肿瘤(n=108)的AF值高于T790M阴性肿瘤(n=16)(相对T790M AF,33.6% vs 16.8%,P=0.004,7)。相对T790M AF增加和最大反应深度并不总相关(R=-0.183),但和AF<10%患者相比,相对T790M AF>10%的患者具有更大的反应深度(P=0.040,7)。但一项关于奥希替尼治疗血浆T790M阳性患者的临床试验中,较小的T790M突变等位基因比例和更大的肿瘤缩小具有相关趋势,反应最好的7例患者中(肿瘤缩小大于50%),3例T790M<0.25%,似乎提示任何丰度的T790M都可从三代TKIs中获益。


T790M的动态变化可能和三代TKIs疗效相关。TIGER-X研究中,NGS检测患者ctDNA T790M突变拷贝数的绝对值,发现三代TKIs rociletinib治疗后,血浆EGFR突变水平下降可能可预测反应深度。检测9例患者尿液,发现不论最佳确认反应为何,第1周期对比基线都出现尿T790M水平的显著下降(范围-51%到-100%;P=0.009,1)。但是在2例PD患者,下降受阻(-51%和-70%),而PR 或SD为最佳反应的患者下降范围为-83%到-100%,反映了rociletinib可降低T790M阳性克隆增殖。


3、总 结

ddPCR、NGS等方法的出现使EGFR定量检测成为可能。尽管临床还没有标准定义及检测EGFR突变的方法,但EGFR突变丰度的检测及其意义已经日益引起人们的重视。不同病灶的不同丰度可以反映肿瘤异质性,EGFR活化突变的基线丰度值可能和TKIs疗效相关,TKIs治疗过程中EGFR丰度的变化对于检测疗效、早期发现进展等具有重要意义。T790M耐药突变丰度的增加可能可早于临床提示一代TKIs获得性耐药,其变化也是三代TKIs疗效的良好预测因子。总之,EGFR突变丰度检测具有十分重要的临床意义。但是当前对突变丰度的应用还存在明显不足。丰度概念混杂,没有统一标准,各种检测方法缺乏绝对可比性。另外,突变拷贝数的检测在一定程度上受到各种标本所含肿瘤细胞的比例不同的影响,而且很多EGFR突变肺癌合并存在EGFR基因扩增,丰度检测是否需要进行肿瘤细胞比例和基因扩增的校正还需要更多的探索。


采编:郭义昆

审校:韩泯、方研


参考文献

1、Goto K, Ichinose Y, Ohe Y, et al., Epidermal growth factor receptor mutation status in circulating free DNA in serum: from IPASS, a phase III study of gefitinib or carboplatin/paclitaxel in non-small cell lung cancer[J]. J Thorac Oncol, 2012, 7(1):115-121.

2、Karachaliou N, Mayo-de las casas C, Queralt C, et al., Association of EGFR L858R Mutation in Circulating Free DNA With Survival in the EURTAC Trial[J]. JAMA Oncol, 2015,1(2):149-157.

3、Yung TK, Chan KC,Mok TS,et al., Single-molecule detection of epidermal growth factor receptor mutations in plasma by microfluidics digital PCR in non-small cell lung cancer patients[J].Clin Cancer Res,2009,15(6):2076-2084.

4、Bai H, Mao L,Wang HS,et al., Epidermal growth factor receptor mutations in plasma DNA samples predict tumor response in Chinese patients with stages IIIB to IV non-small-cell lung cancer[J].J Clin Oncol,2009,27(16):2653-2659.

5、Kimura H,Kasahara K,Kawaishi M,et al., Detection of epidermal growth factor receptor mutations in serum as a predictor of the response to gefitinib in patients with non-small-cell lung cancer[J].Clin Cancer Res,2006,12(13):3915-3921.

6、Bettegowda C,Sausen M,J. Leary R,et al., Detection of Circulating Tumor DNA in Early- and Late-Stage Human Malignancies[J].Sci Transl Med,2014, 6(224):224-247.

7、Zheng D,Ye X, Zhang MZ, Y. Sun, et al., Plasma EGFR T790M ctDNA status is associated with clinical outcome in advanced NSCLC patients with acquired EGFR-TKI resistance[J].Sci Rep.2016,6:20913-20921.

8、Vallée A, Marcq M,Bizieux A, et al.,Plasma is a better source oftumor-derived circulating cell-free DNA than serum for the detection of EGFR alterations in lung tumor patients[J].Lung Cancer,2013,82(2):373-374.

9、Sherwood JL,Corcoran C,Brown H, et al., Optimised Pre-Analytical Methods Improve KRAS Mutation Detection in Circulating Tumour DNA (ctDNA) from Patients with Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC)[J]. . PLoS ONE 11(2): e0150197.

10、非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识,中华医学杂志,2015,95(46):3721-3725.

11、EI Messaoudi S,Rolet F, Mouliere F,et al., Circulating cell free DNA: Preanalytical considerations[J]. Clin Chim Acta, 2013, 424:222-230.

12、AURA 17 , ESMO 2017.

13、Sub-Clonal Therapy by two EGFR TKIs Guided by Sequential PlasmaCell-free DNA in EGFR-mutated Lung Cancer

14、Brief Report: Lung adenocarcinoma harboring EGFR T790M and in trans C797S responds to combination therapy of first and third generation EGFR-TKIs and shifts allelic configuration at resistance.


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