分子诊断技术在肿瘤诊断上的应用

发布时间:2018-04-01       作者:沈佐军       来源:临床实验室        浏览:8222       收藏: 1

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沈佐君  一级主任技师,教授,博士生导师。现任中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)科研处处长、安徽省临床检验中心常务副主任。1995年获中国协和医科大学医学硕士学位,1998年获中国协和医科大学医学博士学位。1998年至2000年美国哈佛大学医学院博士后研究员。现任中华医学会临床检验专业委员会管理学组副组长、中国医师协会临床检验专业委员会常委、中国医院管理协会临床检验专业委员会常委、中国医学装备协会临床检验装备技术专业委员会常委、中国合格评定国家认可委员会实验室技术委员会医学专业委员会委员等。担任《临床输血与检验杂志》副主编、《中华检验医学杂志》编委、《临床检验杂志》编委等。主要从事分子诊断、高效毛细管电泳和液相色谱等技术临床应用研究。


肿瘤是影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一。分子诊断技术在肿瘤诊断、预后和治疗中的应用,主要反映在基因过量表达的检测、基因突变的检测、肿瘤微卫星不稳定性分析、肿瘤的易感性预测、病因检测、早期诊断、肿瘤疗效的监测及预后判断等方面。随着分子生物学的发展,特别是人类基因组计划的顺利实施、人类基因组序列的剖析以及相关基因功能的识别,已经赋予了传统意义上的肿瘤实验诊断以全新的内涵,肿瘤分子诊断也逐渐成为分子医学的重要组成和研究热点。就定义而言,肿瘤分子诊断尚存有争议。有人认为,在分子生物学理论和技术基础上建立起来的诊断技术在肿瘤领域的应用就是分子诊断。也有人认为,从分子水平上完成对与肿瘤相关的核酸(DNA和RNA)和蛋白质这些生物大分子的检测即属肿瘤分子诊断。随着分子诊断的技术发展,人们对肿瘤的本质有了更为深刻和全面的认识,在临床上的应用将更为广泛。


一、肿瘤分子诊断标志物

遗传基因和环境因素共同影响着肿瘤的发生和发展,其中遗传基因是内因,与肿瘤的发生、发展直接相关。通常认为肿瘤是由渐进性的遗传异常驱动的一种疾病,这些遗传异常包括肿瘤抑制基因与致癌基因突变和染色体异常。这里,核酸水平的异常分为两大类:基因突变和表观遗传的改变。具体而言,从分子水平上看,基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。换言之,由于DNA分子中发生碱基对的增添、缺失或替换,而引起的基因结构的改变,就叫做基因突变。表观遗传则是指不引起基因序列改变的可遗传改变,这种改变影响基因表达的变化。表观遗传的变化包括DNA甲基化的丢失、获得,以及组蛋白修饰的改变。遗传基因异常以多种形式表现出来,不同的肿瘤类型、肿瘤发生、发展的不同时期会呈现出不同的遗传基因异常特征,即为肿瘤标志物。这些标志物大致可以分为核酸类(包括DNA和RNA)、蛋白类及其它代谢物等,其中核酸类肿瘤标志物越来越受到临床研究的重视。其主要原因在于核酸水平上的异常是肿瘤发生的早期事件,对肿瘤诊断及早期肿瘤风险预测具有更大的意义。


二、肿瘤分子诊断技术

针对不同类型的肿瘤标志,人们开发了不同的检测方法。总的来说,Western blot、免疫法、质谱法是检测蛋白类标志物的主要手段,分子杂交、PCR和DNA测序是检测DNA、RNA核酸类标志物的基本技术。突变基因的检测方法多种多样,特别是PCR技术诞生后,许多检测技术都是在PCR基础上衍生的。由于PCR扩增需要的模板量少,使对肿瘤的突变分析可以精确到单细胞。近几年新的分子诊断技术不断出现,同时不同技术方法的组合或联合大大提高了肿瘤分子诊断水平,包括诊断的特异性、敏感性和准确性。其中微滴式数字PCR(ddPCR)技术,灵敏度高,且定量更为准确可靠。

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三、肿瘤分子检测技术的应用

随着肿瘤分子诊断技术的快速发展,未来肿瘤分子诊断将全面应用于:肿瘤风险基因检测,肿瘤的早期诊断及鉴别诊断,肿瘤的分级、分期及预后判断,判断肿瘤切除是否彻底、有无转移等。以下几个方面可能代表了肿瘤分子诊断的发展趋势:


1、肿瘤风险基因检测:目前已明确发现某些肿瘤风险基因存在,

这些肿瘤风险基因包括APC(家族性腺瘤性息肉病)、BRCA1/2(乳腺癌及卵巢癌)、HNPCC(遗传性非息肉病性结肠癌)、WT1(肾母细胞瘤)、PTEN(Bannayan-Riley-Ruvalcaba综合征)等等。这些风险基因发生突变等异常与相应肿瘤的发生显著相关,比如现有研究发现约5%~10%的乳腺癌和10%~15%的卵巢癌是由BRCA1/2突变引起的,而在乳腺癌和卵巢癌高发家族中,80%的患者BRCA1/2基因存在突变,而且BRCA1/2突变携带者的发病率随着年龄而递增。通过对BRCA1/2的突变检测,可以反映乳腺癌及卵巢癌发生发展,有利于女性乳腺癌和卵巢癌的早期发现及早期干预与治疗,减少乳腺癌和卵巢癌的发生。


2、肿瘤的鉴别诊断:在拥有可靠的分子诊断标志物和诊断技术

后,我们可对一些临床上的良、恶性增生性疾病进行鉴别诊断。例如,对Bcr区基因重排的检测,可帮助对急、慢性粒细胞性白血病进行鉴别。N-myc和C-myc的扩增和表达检测,对鉴别神经母细胞瘤和神经上皮瘤具有应用价值。


3、肿瘤的预后评估和监测:与肿瘤发生发展密切相关的肿瘤基因

包括癌基因及抑癌基因;癌基因激活和抑癌基因失活是肿瘤发生的两大主要机制。肿瘤预后常常与肿瘤基因状态(突变、扩增及异常表达)密切相关。例如,肿瘤抑癌基因p53基因突变与乳腺癌、肝癌、结肠癌等多种肿瘤预后有关。肿瘤转移抑制基因主要是抑制肿瘤细胞的转移表型,nm23基因是目前研究较多的转移抑制基因。nm23编码的产物具有抑制肿瘤转移的功能,nm23在分化良好的肿瘤中呈高水平表达,且nm23基因表达与淋巴结转移呈负相关,与无病生存期、整个生存期呈正相关,因此检测nm23基因的表达高低,可以作为判断肿瘤有无转移的一个重要指标。从分子水平上判断肿瘤基因的状态,为临床上判断肿瘤预后和预后监测开辟了新的途径。


4、肿瘤的个体化治疗:人体内影响药物代谢最主要的酶系是细胞

色素氧化酶P450(CYP450)。CYP2D6和CYP2C19是CYP450系统最为重要的两种代谢酶。CYP450基因多态性以及对药物代谢的影响,也是药物遗传学研究的最早对象之一。近年来,随着人类基因组测序的完成,对肿瘤发生本质认识的深入,人们发现肿瘤存在很大程度的异质性,同一肿瘤类型患者对同一治疗方案的疗效是不同的,人们开始尝试通过患者基因及其表达状态来预测其治疗效果。例如表皮生长因子受体(EGFR,epidermal growth factor receptor)是一种对肿瘤细胞的繁殖、生长、修复和存活等起重要作用的膜蛋白,目前临床上通过阻断EGFR的活性抑制其磷酸化和信号传导,从而起到抗肿瘤作用,同时也能增加化疗和放疗的抗肿瘤疗效。实践显示EGFR靶向药物(易瑞沙和特罗凯)的疗效存在很大的个体差异,仅有25%-35%的个体有很好的效果。研究发现EGFR基因酪氨酸激酶区域存在多种突变,这些突变主要集中在外显子18-21上,其中以19号外显子内缺失突变以及21号外显子L858R最为常见,这些突变能够很好地预测易瑞沙和特罗凯的治疗效果,为肿瘤用药提供指导依据。美国FDA批准对拟采用易瑞沙、特罗凯等EGFR-TKI治疗的患者进行EGFR酪氨酸激酶基因突变检测。我国《非小细胞肺癌临床实践指南(中国版)》中明确提出EGFR19外显子活化突变在酪氨酸激酶抑制剂药物中的辅助作用。目前临床实践中主要针对EGFR酪氨酸激酶编码区18、19、20、21外显子的突变位点开展检测。


目前临床上应用的一些常见靶向药物列于下表。


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四、肿瘤分子检测技术及其应用进展

随着科学技术的进步,特别是超微量检测技术的突破,肿瘤分子检测技术也取得较大的进展。其中从外周血中捕获有价值的肿瘤生物标志物受到广泛重视。


1、循环肿瘤细胞(CTCs,Circulating tumor cells):越来越多的分子生物学和临床研究结果表明,肿瘤转移很可能在肿瘤发生的早期就已经出现。在外周血中检到CTCs是预示肿瘤转移最直接、重要的方法,在肿瘤早期转移的临床诊断、预后判断、监测疗效等方面具有重要意义。CTCs的发现有望改变临床上仍依赖于影像学检查及传统肿瘤标志物的现状。由于外周血中的CTCs含量极为稀少,一般认为在外周血中大约105~107个单核细胞中才有一个CTCs,因此对CTCs检测技术的灵敏度和特异性提出了极高的要求。目前各种CTCs的检测系统主要包括CTCs分离和富集系统以及CTCs的检测和鉴定系统。而分离和富集系统对检测外周血的CTCs是非常必要的。


2、游离核酸(ctDNA,Circulating Tumor DNA):由于体内肿瘤细胞坏死后有少量DNA(其往往携带肿瘤细胞突变或重组的基因,能反映肿瘤细胞的准确信息)会进入循环系统,因而可以利用DNA扩增或高通量测序等技术检测并计数。同时,该方法具有无创的特点,可以早期、廉价且多次获得体内肿瘤DNA的信息。ctDNA检测的另一个用途是动态检测肿瘤效果,比如在治疗的不同时间点对ctDNA进行定量分析。一些小规模的研究对这一方法进行了验证,能够从一定程度上显示ctDNA水平和肿瘤对药物响应的相关性。此外,也有研究表明ctDNA能够比影像学更早地发现耐药突变。正如任何其它检测方法一样,液体活检也需要大规模的队列研究来确定其对不同疾病的有效性和敏感性。在激进的临床应用背后,扎实的临床有效性和临床效用评价也需要及时跟上。


3、外泌体(exosomes):最近几年,一种叫做外泌体的小囊泡正受到大家广泛的关注。外泌体是直径约为30-150nm,密度在1.13-1.21g/m1的小囊泡,天然存在于体液中,包括血液、唾液、尿液和母乳。外泌体可以携带的不同蛋白质能够发挥不同的生物学功能。例如,肿瘤细胞分泌的外泌体能够介导血管再生肿瘤细胞增殖及免疫逃逸;而树突状细胞源性外泌体则能够引起机体有效的抗肿瘤免疫应答。目前研究发现,外泌体内含有与细胞来源相关的蛋白质rRNA和microRNA,并且外泌体能够通过生物屏障,在细胞间传递功能性核酸分子,从而发挥各种生物学功能,故外泌体有望成为一种新型给药途径及基因治疗载体。外泌体携带蛋白质包括源细胞非特异性和源细胞特异性两类蛋白分子。前者可能与外泌体的生物发生和生物学作用有关,主要包括:细胞溶质蛋白、参与细胞内信号转导的蛋白、各种代谢酶、热休克蛋白和四跨膜蛋白;另一类是特殊蛋白质,这类蛋白质只存在于某种特殊的细胞分泌的外泌体,而这些特定细胞源的外泌体与其生物学功能有着密切联系。

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总之,分子诊断技术在肿瘤风险基因检测、肿瘤的鉴别诊断、肿瘤的预后评估和疗效监测、肿瘤的个体化治疗等方面的研究已取得了一些进展。随着分子生物学技术和肿瘤机制研究的进展,肿瘤分子检测技术在临床检验中的应用一定会越来越广泛。


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