质量控制•保驾护航 —— 实验室质量控制回顾

发布时间:2017-12-01       作者:DDM       来源:临床实验室        浏览:1229       收藏: 0

在《生化》专刊中,来自北京医院、国家卫计委临床检验中心的李婷婷、王治国两位老师撰写了《标准化西格玛性能验证图在常规化学检测项目性能评价中应注意的事项》一文。西格玛(σ)在数理统计中表示“标准差”,用来表征任意一组数据或过程输出结果的离散程度,其水平越高,过程满足顾客要求的能力就越强。6σ管理最早用于工业管理,在检验医学中的应用最早由国外学者Nevalainen提出,将实验室差错或缺陷率转化为σ水平进行评价和管理,6σ质量水平意味着100万次机会中有3.4次缺陷的可能,或者也可由公式σ=(TEa-|Bias|)/CV计算获得,其中TEa为允许总误差(%),Bias为偏倚(%),CV为变异系数(%)。公式中的分子和分母同时除以TEa则可得到σ=(1-|Bias|/TEa)/(CV/TEa),然后以|Bias|/TEa为纵坐标,CV/TEa为横坐标,即得到标准化西格玛性能验证图。在标准化西格玛性能验证图中由于横坐标和纵坐标都通过除以TEa进行了标准化,所以即使不同的检测项目具有不同的允许总误差,也能在同一张西格玛性能验证图上展示各自的检测性能。但是要想利用标准化西格玛性能验证图对常规化学检测项目性能进行准确适当地评价,在图中正确找到特定项目性能所对应的操作点是关键,即确定操作点的横坐标(CV/TEa)和纵坐标(|Bias|/TEa)。所以最主要的问题是如何准确地获得待评价方法的CV和Bias,本文着重阐述了应用西格玛性能验证图评价常规化学检测项目性能时的注意事项。


在《临检》专刊中,《尿液微粒鉴别的室间质量评估:北欧经验》一文写道,公众熟知的芬兰EQA服务供应商Labquality Ltd从上世纪80年代就开始提供尿液分析室间质量评估(EQA)计划。2014年,参加尿液微粒鉴别计划的实验室已达329家之多,其中60%来自芬兰以外的19个国家。四份网络年刊的每一份都刊登了来自单一患者样品的斯顿海默染色图片,这些图片都经过明场显微镜和相衬图像光学检查。参与者报告了基准水平或升高水平的分类。参与的实验室收到了对其分析性能的评估结果以及与其他实验室对等分析的比较结果,包括临床数据对照和标本的分析前细节。总的来说,2013-2014年间,8个计划成功地得出了基本尿液微粒的报告:红细胞82%-92%;白细胞82%-97%;鳞状上皮细胞92%-98%;管型84%-94%以及小型上皮细胞73%-83%(期望或合格报告的最小值和最大值)。这一有差异的基本水平用于日常实验室报告或作为自动仪器生成结果的验证。还需要相当大的努力标准化国内评估程序和报告格式,进而改进国际间的评估结果。未来的技术可能有助于减少单一数字图像产生的限制。尽管有所改进,但是变性的细胞和管型还总是呈现中间类型,并形成有争议的分类。这就是性能评估应该将调整过的合格分类包括到已评估结果内的原因。分析前细节和临床细节为形态学发现提供了关键的附加价值。《意大利尿沉渣室间质评(EQA)计划:2012-2015期间的结果》一文写道,人工显微镜检查仍然是尿沉渣(US)检查的金标准。研究者报告了2012-2015期间意大利 US EQA计划的结果,至今包括大约260家实验室。该计划每年包括四个调查。在两个调查中,要求参与实验室提供US颗粒的鉴别和临床关联。在另外两个调查中,要求参与实验室提供临床案例的诊断,呈现图片、一些关键的实验室发现和短期临床历史。共提供了66张US颗粒(21张细胞、2张脂质、21张管型、10张晶体、3张微生物、15张污染物)的图片和7个临床案例。每种类型颗粒的正确识别率,按照降序排列是:微生物(均值±SD:92.4%±4.5%),脂质(92.0%±1.8%),管型(82.8%±8.8%),晶体(79.4%±29.8%),细胞(77.3%±13.5%),及污染物(70.9%±22.2%)。对于13种颗粒,91.5%±11.7%的参与实验室指出了正确的临床关联,对于与尿路感染相关的颗粒,这个数字是52.7%。对于临床案例,由于较高的颗粒错误识别率,只有44.3%±10.1%的参与实验室获得了临床诊断,其中92.5%±5.3%做出了正确的指示。结论:该EQA计划的结果证实了,有些US颗粒的鉴别、临床关联和临床意义众所周知,而其它颗粒并非如此,这是鼓励US EQA计划的重要原因。


在《POCT》专刊中,北京医院、卫计委临床检验中心的黄钰竹、王治国两位老师撰写的《便携式血糖仪——适合的临床用途》一文指出,监测血糖可管理糖尿病患者的治疗,包括胰岛素用量、口服抗血糖剂的使用以及测量饮食和/或生活方式的改变。Boyd和Bruns建立模拟模型以复制葡萄糖检测不精密度和偏倚对胰岛素剂量的影响,以此确定血糖监测的理想分析性能。利用蒙特-卡罗模拟法将随机血糖真值转化为观察血糖值。血糖真值范围为8.3-25.0mmol/L,其增量和胰岛素剂量的递增模式相同,当模型中的不精密度和偏倚增加时,会产生正确或是错误的胰岛素剂量决策。总分析误差为5%时,观察到8%-23%不正确胰岛素剂量,而当不精密度增加到10%时,不正确胰岛素剂量从16%增加到了45%。当不精密度和/或偏倚的结合超过10%,在>5%的情况下发现更大的胰岛素剂量误差。为保证胰岛素剂量在95%的例子中是正确的,根据平均葡萄糖浓度和胰岛素使用方案,偏倚和不精密度需<1%-2%。尽管这些剂量改变和患者检测结果不直接相关,但它强调不精密度和偏倚达到最低时的重要性及使用不精密的血糖检测方法的风险。由于血糖仪的广泛使用,关于特定临床情况下血糖仪的准确度和可靠性问题随之而来,尤其是和重症监护相关的问题。这些问题涉及血糖仪在患者管理中的有效性,或者说如果血糖仪被过度使用或在不能实现预期结果的情况下使用,会导致不适当的患者管理并最终导致医疗费用的增加。血糖仪受到众多因素的干扰,包括内源性和外源性患者因素,如怀孕、药物、环境因素和操作因素。血糖仪应在基于临床需要、专业建议和监管要求的客观质量规范下进行评估。目前,对血糖仪的分析性能还没有达成共识,尽管监管和专业机构如美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)、美国疾病控制和预防中心及美国糖尿病协会(American Diabetes Association,ADA)进行过无数次的尝试,但仍未探究出血糖检测的普遍可接受的标准。由于血糖仪还没有通用的质量规范,因此很难比较已发表的相关研究。ADA已建议在所有浓度上血糖仪与实验室方法一致应在±15%以内。ADA未来的目标是所有血糖浓度这一标准应降低至±5%。国际标准化组织(International Standards Organisation,ISO)修订了其标准(ISO15197),目前的状态是当血糖浓度<4.2mmol/L(<75mg/dL)时,95%的个体血糖值应在厂商检测值的±0.83mmol/L(15mg/dL)内,当浓度≥4.2mmol/L(≥75mg/dL)时需在±20%以内。利用ISO15197性能标准,患者血糖浓度为6.1mmol/L时,血糖仪的报告浓度则会从5.0到7.2mmol/L,因此患者会被诊断为糖尿病或非糖尿病。根据普遍接受的指南,若空腹血糖浓度≥7.0mmol/L或餐后两小时血糖浓度≥11.1mmol/L时则可诊断为糖尿病。虽然不建议将毛细管血糖检测作为诊断糖尿病,但这样的结果变化可能导致不正当的患者管理,同时证明血糖仪不可用于糖尿病诊断的原因。FDA和ISO17511要求实验室方法的测量结果必须溯源到参考物质。此外,建议血糖监测系统的检测结果应溯源到决定性参考方法和一级参考物质。体外诊断医疗器械的指令98/79/EC也要求体外诊断医疗器械的校准能溯源到参考方法和/或更高计量级别的参考物质。除此之外,国际检验医学溯源联合委员会(Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine, JCTLM)强调一个合适的参考系统不仅包括已定义的参考方法和参考物质,还包括认可的参考测量实验室。如果检测血糖的系统通过不间断可比对测量链可溯源到最高标准,则血糖监测系统仅能符合分析质量的最高要求。同位素稀释气相色谱/质谱法(ID-GC/MS)是国际公认的用于确定葡萄糖质量浓度的权威参考方法。己糖激酶法是二级参考方法,该方法是公认的标准方法。由ID-GC/MS方法赋值的校准品和质控品来校准和监测己糖激酶参考方法。由此断定,血糖监测系统校准到基础设备,如YSI血糖分析仪,并不能保证测量结果的正确度。血糖仪的性能要求将依赖于仪器的预期临床用途是一个合理的假设。迄今为止,还不存在可匹配实验室方法分析性能的仪器。因此,我们必须声明如果血糖仪和实验室性能不匹配,就不能用于诊断,但是糖尿病患者的管理已对血糖仪产生依赖。因此仪器根据其预期用途使用是十分重要的。尽管厂商有责任继续改进仪器性能,但科学家和糖尿病医疗专业人员需承担保证临床环境中所用血糖仪是“符合目的”的责任。通常情况下,购买血糖仪是由没有临床或科学经验的采购员完成并决定仪器是否符合预期的临床用途。当尝试设置血糖仪的性能要求时,之所以专业学会受到挑战是因为血糖仪广泛用于多个性能要求不同的临床环境。仪器设备需要根据临床用途分为具有最低(临床可用)和最佳(指南可接受)的性能要求。许多设备可能无法实现最佳要求,但如果它们实现了最低要求,则便可安全用于医疗。血糖仪试纸条技术和使用的检测方法影响着血糖仪的干扰类型。目前,葡萄糖试纸条使用的酶主要是葡萄糖氧化酶(GOD)或葡萄糖脱氢酶(GDH)。两种酶被耦合到辅助因子,如黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD),烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或吡咯喹啉醌(PQQ)。葡萄糖试纸条上分别有脱水酶,当血液滴加在试纸条上时,再水合并与酶反应产生产物血糖仪能够检出。如果使用的酶是葡萄糖氧化酶,葡萄糖被氧化成葡萄糖酸和过氧化氢,而如果用的是葡萄糖脱氢酶—吡咯喹啉醌氧化葡萄糖产生葡萄糖酸内酯,并将NAD转化成NADH。血糖仪通过比色或电流检测葡萄糖浓度。为更好地理解为何仪器的使用须符合临床用途,需要了解在不同临床情况下影响血糖检测质量的因素是什么。如果不考虑潜在干扰,我们得到的错误结果会导致不正确的给药方案,因此可能导致低血糖、昏迷甚至死亡。患者对如何正确使用血糖仪系统(仪器、试纸条和毛细管采集)及自学往往没有得到适当的教育。这会导致用户缺乏对正确程序的理解,如使用仪器时洗手、不使用正确的编码芯片或厂商说明书、使用过期试纸条、将试纸条暴露于光和高湿度下。本研究探索了不正确编码的影响,结果表明在内分泌科中大约16%的患者不正确编码血糖仪,导致-37%到﹢29%的平均误差。一项关于采集毛细管样品前洗手对血糖值影响的研究表明,如果不洗手将会得到错误的血糖结果。如果用酒精棉签代替洗手则不会出现这种影响。令人担忧的是,日本对所有血糖仪的说明书进行了仔细检查,但却没有发现任何关于检测前洗手的相关建议。本文强调了在选择血糖仪时我们需要考虑到的临床用途,这将决定我们需要考虑的预期分析要求和潜在干扰因素。重要的是要记住无论是在家庭中还是在重症监护室中使用血糖仪,得到最佳检测结果的首要因素是教育。尽管教育能解决许多影响结果的检验前因素,厂商和临床实验室人员应合作解决标准化及试纸条性能问题以实现预期患者结果,IFCC通过其由科学家和厂商组成的床旁工作组正在积极地解决这些问题。


在《肿瘤》专刊中,本刊顾问冯仁丰老师撰写的《临床实验室检测系统分析性能Sigma验证的必要性—从单次检测特性去认识和思考》一文从紧紧抓住临床实验室的最突出表现,认识临床实验室开展质量控制的误差概念和建立总允许误差的重要性、实验室开展检验必须依赖检测系统,开展质量控制实际是对检测系统质量的控制、Westgard Sigma验证程序的意义、总的QC计划、不确定度及与误差概念的区别等几个方面进行了论述。北京医院、卫计委临床检验中心李婷婷、王治国两位老师的文章《临床分子遗传试验确认和验证的标准化框架》指出,实施用于诊断的分子遗传试验的过程是复杂的,且涉及许多水平的评价和确认。美国ACCE框架中详细阐述过程的关键组分是试验的分析确认,临床确认,临床效用及伦理、法律和社会的影响的考虑。在决定建立诊断性试验后,就必须选择要使用的技术及建立合适的实验室过程。开发阶段涉及到对诊断和过程中使用的技术的评价以确保获得的测量与诊断问题有关以及可清楚地确定分析物(即没有混杂因素)。实验室过程的最后阶段是确定试验的性能即准确度是否满足所需的诊断标准。执行的分析确认或验证是否能实现取决于存在的适当的性能规范,其详细说明了在给定的条件下试验的预期的准确度。分析确认或验证的结果决定了试验是否或将如何实施及设定试验性能监测(持续验证)的要求。为了提供更详细和具体的指南,Eurogentest成立了一个工作组,包括临床和实验室科学家以及来自欧洲和美国质量保证和统计学专家。目的是开发一个用于确认的框架,它可以广泛的应用于实验室提高遗传检测服务的整体质量,并尊重施加的灵活性需求,例如地方的要求和法规以及如检测量和资源实际的限制。在最近研究中,Jennings等人已提供对FDA规章深入的讨论,以及对确认程序很好的评论。然而,对分子遗传试验的标准和实际指南的具体解释仍然缺乏。在本文中,作者提出了一种用于诊断用途的分子遗传试验的确认和验证的通用的方案。本文介绍了人类分子遗传学试验分析确认和验证过程从而提供ACCE框架中的第一个部分的工作细节。这些过程是为了确证特定的实验室过程或试验提供与预期诊断用途相一致的可靠性。分析确认/验证只涉及实验室过程,而不对试验建立的决定、临床确认、临床效用或试验的伦理、法律和社会的影响进行评价。特别是,试验的临床的相关性以及所选择的测量相对于诊断特定遗传疾病的适用性由专业的人员判断。关于发展和确认的确切界限有许多的讨论,好的案例可用于不同的分类。为了简单,作者已经规定了明确的界限,将所有与试验应用的发展(即范围之外)和与试验准确度相关的参数的概念都放置于确认中。这些范围的界限不应该用于对不同过程的不同重要水平的设定;为了用于临床,很明显适当的检测结果的关键在于建立有效的诊断试验。为此,作者概括了在开发阶段涉及的过程和应该考虑的重要因素的简单选择。虽然作者也关心统计学和样本大小的适当应用,但本文不打算论述此方面内容,但诊断分子遗传学家的实用指南以帮助他们希望实施的试验的确认或验证的设计、实施、适当的报告。参考文献中已经提供了更复杂的统计学概念,但建议在有疑问的情况下征求统计学家的意见。虽然确认和验证必须仔细考虑,但是试验的实施也必须可实现的而不是负担过重。虽然有许多关于确认的更加一般层面的文献,但是作者试图确定和组织分子遗传诊断中确认/验证要求的组成部分,并最终概括了一些简化的统计学算法和解释。因为没有充分覆盖领域中知识、经验和情景,确认/验证指南有必要变得更加复杂,所以本文可以成为后续制定此指南的出发点。虽然这些建议主要针对分子遗传学检测,但作者相信原理和概念也适用于细胞遗传学。


在《输血》专刊中,北京医院、卫计委临床检验中心的段敏、王治国撰写的《输血医学中的分子检测》一文指出,输血医学检验的重点是检测红细胞(red blood cells,RBC)和/或血小板的细胞膜表达的抗原以及患者血浆中存在的抗RBC或血小板抗原抗体。 对这些抗原和抗体的检测至关重要,因为如果某抗原是阳性的血液被输入到具有抗该抗原抗体的患者体内,则患者RBC或血小板系统针对该特异性抗原发生的排斥反应会导致血制品的存活下降、溶血性输血反应、超级溶血反应甚至死亡。传统上使用血清学试验检测RBC和血小板抗原和抗体。这些试验几乎都是基于血细胞凝集的原理来表明待测血清中存在特定的抗体以及待测RBC或血小板表面存在特定的抗原。例如,正向分型是通过将患者的RBC与已知的抗A、抗B和抗-D抗血清进行反应来检测患者的RBC抗原。任何导致RBC发生凝集的反应都能说明RBC表面具有该特异性抗原(例如,抗A反应中的凝集现象表明RBC膜上存在A抗原)。 血清学试验的凝集反应依赖于待测抗体的凝集能力,如ABO血型检测中的IgM类抗体,以及抗人球蛋白抗体、抗C3抗体等抗IgG类二抗。关于分子检测的优势,本文指出分子检测与大多数输血医学检验应用的传统血清学检测是互补的。分子检测无法代替血清学检测,血清学检测仍然是输血医学检验的支柱。血清学检测的特征很好,足够敏感,可以发现并鉴定大多数临床上重要的同种抗体,对大多数患者情况都是有用的。然而,血清学检测在某些特定患者和情况下具有一定的局限性。这些情况包括:具有混合抗体(热或冷自身抗体、冷凝集素,被动携带母体抗体的新生儿)的患者;携带没有相应检测抗体或抗血清的抗原或抗体的患者(部分或变异抗原、罕见抗原、高发病率抗原);有混合循环RBC或血浆的患者(最近输血、骨髓移植后、血浆置换后);需要确定抗原配型的患者;献血者的大规模筛查。在上述任何一种情况下,血清学检测的灵敏度和特异性都会受到限制,或者可能在时间、努力或成本方面望而却步。鲜为人知的自身抗体或多种同种异型抗体在试验反应中会引起意外的凝集。这会导致无法排除同种异型抗体的可能性,因此使得它很难或不可能确定患者血清中存在的任何临床上有意义的同种异型抗体。由于可用的抗血清和抗原阳性的测试RBC的种类有限,可能无法有效地识别抗低发性抗原的抗体。类似地,由于缺乏市售的抗血清或抗原阴性的红细胞试剂,可能难以确定高发性抗原的抗体。在接受多次RBC输血的患者中,输血的红细胞可能会掩盖患者天然RBCs表面存在或不存在的所感兴趣的抗原。同样地,由于输注血浆的掩盖或稀释作用,接受多次血浆输注或自动血浆置换的患者的血清不能用来自患者的天然免疫系统的抗体进行评估。对于许多RBC或血小板抗原,通常不能通过血清学方法来区分纯合子和杂合子患者的表型。例如,尽管有“剂量”的概念,但是当RBC试剂携带特定表型的纯合子与杂合子时,对于仅具有特定等位基因一个拷贝的红细胞与具有两个拷贝的红细胞,观察到的二者的血细胞凝集强度基本相同。由于可扩展性差,成本高和有限的自动化选择,对RBC或血小板抗原状态的大规模筛查是一项艰巨的任务。因此,每个血液成分单位必须使用劳动力相对密集的技术单独检测每种抗原。对于以上任何一种情况,分子检测能确定患者或献血员所表达的抗原。对患者表达抗原的测定也可以用于预测患者可以产生哪些同种异型抗体(因为个体只能仅针对其自身缺乏的抗原产生同种异型抗体)。但是,分子检测在输血医学中的应用也具有一定的局限性。主要是分子检测提供了关于患者基因型的信息,因此不能确定患者血清中任何抗体的特异性。由于分子检测只能确定患者所产生的抗原,因此,只能确定患者理论上可以产生的抗体的抗原特异性。具有未知抗体(或抗体)的患者可以在分子水平进行分型:表达D、C、e和Jk(a),但不表达c、E和Jk(b)。仅基于该信息,患者血清中的抗体可以对抗原c,E,Jk(b)的任何一个或多个或对分子检测无法鉴定的另一种RBC抗原产生特异性反应。这时需要血清学检测来确定患者抗体的特异性。分子检测是针对人群中普遍存在的预期多态性的频率而发布的。因此,它局限于具有丰富等位基因(例如,ABO血型系统)以及编码基因未知的抗原的基因检测。此外,使用等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)进行的分子检测是基于大小进行确定扩增子,其无法检测点突变、倒置或其他不会改变靶向引物位点或扩增子大小的DNA序列的改变。在这一点上,大多数机构正在批量进行分子检测,因此增加了周转时间,结果导致对于不复杂的患者,分子检测可能比血清学检测还要明显慢很多。最后,如果可行的话,分子检测结果应该使用血清学检测进行确认,因为基因检测以外的遗传决定簇(如启动子)可能影响该抗原的表达。这会导致把实际上没有表达该抗原的患者或者献血者标记为抗原“阳性”。例如,尽管D-阳性个体携带RHCE基因,但用血清学检测其任何RHCE抗原都没有明显的表达。这种表型是由于第6外显子中单个核苷酸(907C)缺失而引起终止密码子提前出现,最终导致RHCE基因的沉默。同样地,依赖顺式或反向取向不同表达的等位基因,也会导致表型和基因型检测方法之间的结果差异。关于分子技术在输血医学中的应用,目前用于输血医学检测的分子技术都是基于来自患者或献血员DNA序列的扩增。检测的目标是决定红细胞或血小板抗原决定簇产生的基因。这些技术可以辅助血清检测确定捐献的血液产品中细胞膜上表达的抗原或者输血受体的细胞膜上未表达的抗原。这些技术有助于确定受体可能产生针对哪些抗原的抗体,从而预测未来输血可能发生的不相容。输血检验特别适合采用分子方法,因为大多数试验评估的是组成的基因表达(胚系表达),从而可以避免在针对胚系基因背景下的体细胞突变的分子检测中所遇到的灵敏度问题。目前的检测方法包括各种变换的PCR、限制片段长度多态性(restriction fragment length polymorism,RFLP)、Sanger测序以及高通量多重PCR。最常用的检测方法是具有等位基因特异性引物的PCR和传统凝胶电泳或毛细管电泳检测扩增子,可以使用市售的试剂盒,或者公开的或内部的方案。这种方法的缺点是必须为每种待测抗原建立单独的PCR反应体系和单独的检测试验(凝胶或毛细管电泳)。这是一个相对较慢的劳动密集型操作过程。然而,在小批量分子检测的实践中,这些试验在支持技术方面需要相对较低的投资。使所需劳动力最小化并增加单次试验信息输出的方法之一是多重分子检测,在单次反应中使用多种PCR引物设置用于检测多个等位基因特异性RBC抗原基因。有各种多重方法,每种都使用特定的检测方法报告通过多重PCR产生的等位基因扩增子。目前市场上销售的有三种使用多重PCR的系统,分别是HEA BeadChip系统和LifeCodes RBC(均属于Immucor Inc,Norcross,GA,USA)和BLOODchip(Progenika Inc,Medford,MA,USA)。在BeadChip系统中,生成的PCR扩增产物与结合荧光磁珠的等位基因特异性的探针进行杂交。如果序列是匹配的,探针将通过PCR扩增,含荧光的产物增加,从而被检测出。然后通过分析荧光磁珠图案可以确定PCR产物的种类,从而确定患者DNA中对应的基因种类。在BLOODchip系统中,扩增产物被分割成片段并用荧光基团特异性标记。然后将标记的片段和与阵列结合的等位基因特异性DNA探针进行杂交,通过询问产物荧光模式确定每种抗原所存在的扩增片段。LifeCodes系统使用多重RBC抗原等位基因特异性多态性,通过使用荧光捕获磁珠平台进行检测。使用该系统时,可以利用单次多重PCR反应来确定Rh、Kell、Kidd、Duffy、MNS和Dombrock抗原系统的基因型。第二次多重PCR可用于确定Colton、Dombrock、Scianna、Lutheran、Diego、Landsteiner-Wiener(LW)、Cartwright、Knops和Cromer抗原系统的基因型。PCR过后,应将扩增产物与结合寡核苷酸探针的荧光磁珠进行孵育。探针选择性地结合每个抗原等位基因的PCR产物。然后使用流式细胞仪检测DNA结合的磁珠。使用多重PCR反应和单次流式细胞仪可以检测大约25个抗原单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP),与检测每种抗原SNP产物的PCR反应相比,大大增加了分子检测的效率。由于大多数RBC抗原的等位基因数量有限,所以它们适合采用等位基因特异性PCR进行检测。然而,对于某些遗传变异性较大的基因(如Rh基因),目前可使用DNA测序确定其特异性的遗传变异。尽管下一代测序技术在输血检验中的应用正在研究中,但最常用的还是Sanger测序。Sanger测序是在单向PCR中逐步使用标记的末端核苷酸进行终止,然后使用凝胶或毛细管电泳分析每个PCR产物的长度与终止碱基的位置的关系,从而获得可见的DNA碱基序列。本文还介绍了红细胞抗原表达、血小板抗原表达、细胞游离核酸检测等内容。


在《免疫》专刊中,北京医院、卫计委临床检验中心的黄钰竹、王治国两位撰写的《免疫组织化学检测设计控制过程及标本要求》一文从免疫组织化学检测的预期用途和适应性、设计控制过程的验证、免疫组织化学检测标本要求、免疫细胞化学标本制备过程、组织处理相关问题等几个方面论述了临床免疫检测的质量控制问题。对于免疫组织化学检测的预期用途和适应性,本文指出IHC检测包括:分析物,即靶分子(抗原),生物标志物,被测量;待检测的标本,即检测系统的基质(组织或细胞);在检验前(分析前)标本采集;试剂或过程的前处理;手工或自动染色系统;试剂,即前处理试剂、一抗、阴性对照试剂、检测试剂、底物;用于检测系统确认的校准品;验证每个终端实验室整个检测系统的质控品;观察组织切片IHC反应后的评分算法;IHC的临床应用,即提供数据以支持临床预期人群特标标本的医疗决策。研究者、实验室试验开发人员或制造商可以发现并开发免疫组织化学分析过程,商品化制造商通常开发用于大规模检测的IHC检测,虽然文献中已有IHC检测从发现到完成测试的支持性数据,但仍需进一步的研究建立分析正确度,研究的内容包括抗原的鉴定和分离、抗原的量化、蛋白质化学技术以及抗原转染细胞系的基因识别技术。动物抗体的诱导包括免疫动物、生产单克隆或多克隆抗体,并考虑哪种抗体能与常规固定、加工的组织标本上的抗原发生反应。IHC的预期用途涉及研究者、试验开发者、制造商、病理学家、临床医生及提供标本的患者,决定了检测的性能规范特征,这一点适用于所有项目的IHC检测。IHC检测应用功能免疫学和形态学,包括肿瘤细胞谱系的鉴定;受体活性或通路活化;导致疾病或治疗的生物学过程或通路的基因蛋白产物;疾病自然史或常规治疗的预后标记;以及治疗选择和监测的预测性标记。生物标志物的量化及性能特征的鉴定包括特异性、敏感性、重复性及稳定性。关于设计控制过程的验证,IHC检测的开发者可以是基础研究员、实验室项目的开发者或商品化试剂的制造商。所有开发者应收集客观理论依据以确保设计实施的每一阶段(如用免疫印迹法检测特定抗原抗体的免疫反应性)满足规范。实验室可以用其他技术评估抗原抗体的交叉反应性、亲和性、亲合力以及组织固定的最佳类型。根据预期用途检测阴性、阳性肿瘤验证灵敏度和特异性。所有开发者须应用临床患者标本确认IHC检测的每一步骤,并记录满足预期用途的客观检测结果。IHC检测设计控制过程的确认是确定鉴定靶抗原的方法,及分析和临床性能特征是否满足IHC检测预期用途的重要过程。对于分析和临床性能的确认而言,通过独立比较检测的临床结果确定具有一定频率的预期阳性、阴性结果,从而应用终产品检测一系列患者标本。对于确认过程而言,可在检测环境中应用和产品设计类型相符的IHC检测。IHC检测确认的过程分为检验前、检验中和检验后:(1)检验前(分析前):选择分析类型和标本类型,标本收集、保存、固定、处理、加工、包埋、切片、载玻片制备、抗原检测;(2)检验中(分析中):显微镜观察;(3)检验后(分析后):通过手工或自动显微镜观察已制备好的IHC载玻片,报告结果,研究并根据解释和建议作出临床决策。为确保检测系统的质量,研究者、终端实验室及制造商必须有客观的检测程序。根据预定义的质量标准将每个新批次的试剂与参考批次进行比较,确保性能一致。多克隆抗体的基本定义是由单一动物产生所有的抗体,而单克隆抗体的定义应包括抗体的加工和制备。终端用户应检查收到的每样试剂,由于试剂可能受不同条件的影响(包括运输和储存条件),即使试剂来自相同批次,也不可能全部货次的试剂均满足规范。在美国和其他国家,商品化的IHC试剂盒是由制造商提供的说明书、前处理试剂、一抗、检测试剂以及阴阳性质控材料组成。当终端实验室的病理学家想评估将新IHC试剂盒引入到其实验室的可行性时,可根据制造商的使用说明进行测定。该测定过程的目标是确定IHC检测的临床效用。从研究人员到终端实验室病理学家,每个执行IHC检测的实验室必须执行质量控制和质量保证过程,以保证IHC检测的性能规范。除此之外,还须研究IHC检测的临床效用,研究过程可能涉及研究者、开发者、制造商对IHC检测的验证及终端用户的相关性研究。在设备最开始使用时应规范其临床效用,发现新的应用程序。在不改变检测性能的情况下,不需要对分析进行额外的验证或确证研究;如果检测性能发生改变,则该分析须被视为新的检测项目进行验证和确证研究。对于免疫组织化学检测标本要求,从标本采集、标本处理、标本固定、固定后处理、切片等几方面进行了详细介绍。关于免疫细胞化学标本制备过程,细胞标本,无论采自刮取材料、涂片、体腔液,还是通过针管吸取,都是用于免疫细胞化学评价很好的材料。由于酶的预处理及“抗原修复”技术在处理过程中会造成标本“洗脱”,建议用干净的载玻片预处理容易洗脱的组织。从体腔液中获取的细胞块通常固定在福尔马林中,而大多数细胞学标本固定在乙醇中。病理学家必须牢记不同固定剂所致的免疫细胞化学染色模式的差异。从体腔液中获取的细胞块的染色方法与甲醛固定石蜡包埋组织相同。细胞学标本的染色方法应与IHC的不同,例如,对于手术病理标本而言,细胞标本的染色时间更短。建议每个实验室单独验证细胞学标本,并用患者标本进行细胞学标本检测的质量控制。在拿去盖玻片后,通常用PAP染色法进行免疫细胞化学染色。关于组织处理相关问题,在组织处理过程中可能遇到的问题包括:(1)部分固定(固定时间<24小时),使免疫反应呈异质性,部分区域丧失反应性;(2)凝固剂和交联固定剂之间的不均匀固定,导致整个组织出现可检测的异质性;(3)过度固定(固定时间>72小时),使得免疫反应性部分或完全缺失;(4)固定不足(固定时间<6小时),使得免疫反应性部分或完全缺失;(5)在固定或处理过程中温度过高,产生“煮熟”样外观;(6)未监测试剂导致组织处理不当;(7)机械原因造成组织处理器故障,可能需要二甲苯或固定剂进行“二次加工”,并重新处理,实验室应预想到这种情况下组织形态学和抗原性的变化。


在《心血管疾病》专刊中,北京医院、卫计委临床检验中心的李婷婷、王治国两位撰写的《高敏心肌肌钙蛋白检测:从改进的分析性能到加强风险分层》一文指出,与现在的敏感cTn试验比较,高敏心肌肌钙蛋白(high-sensitivity cardiac troponin,hs-cTn)检测因其卓越的分析性能旨在进一步促进临床决策。hs-cTn检测的能力是可以检出至少50%健康个体中的可测量的cTn浓度,并具有改进的精密度(在第99百分位数URL变异系数(CV)≤10%表达),不仅将导致疑似MI患者增强的风险分层,也能够使这些检测作为其他患者亚群潜在的预后工具。本文的目的是整合有关hs-cTn检测的实验室和临床知识以便促进其在日常实践中的优化应用。主要关注于hs-cTn检测在疑似MI患者中的作用,讨论推荐的诊断算法及其解释。重点也放在心肌损伤后cTn的释放,用于cTn免疫检测中的抗体的特点,以及hs-cTn检测的分析性能。本文也综述了在确定第99百分位数值时健康参考人群的选择,hs-cTn的生物学变异,以及hs-cTn试验间的差异中可能遇到的问题,也概述了cTnI标准化的现状。最后详细讨论了hs-cTn检测用于诊断和预后的价值,包括非冠心病导致的cTn升高,cTn床旁检测(POCT)潜在的利益和风险,以及一些临床医生对hs-cTn检测的开展不正当的怀疑。


在《自动化及实验室管理》专刊中,刊登了北京医院、卫计委临床检验中心王治国、叶圆圆的文章《专业化的医学实验室信息系统》。文章首先对专业化的实验室信息系统作了概述。指出专业化的LIS设计用于很好地执行有限数量的功能,而不是试图服务于整个实验室的需求。因为专业化的LIS比一般LIS的定制化程度更高,它们可以采取多种形式。例如,专业化的LIS可以安装在现有的LIS体系结构中可以作为独立的商业应用而存在。或者,它们可能包括明显增强或定制分拆或现有的LIS模块。此外,在亚专业登记是常态的实际情况下,具体专业化的LIS或LISs可满足机构的所有需求。在少见的情况下,专业化的LIS可以完全由内部开发作为实验室的支柱。对于LIS的不足之处,分四个方面进行了论述。关于现有的LIS的潜在不足,指出某些实验室或实验室部门具有独特的需求,传统的临床实验室系统可能无法解决。造成给定实验室现存LIS感知到的或实际的缺陷的因素通常是复杂的和多因素的。在大多数情况下,实验室部门不具备选择LIS的权利。通常,现有LIS的实验室将其功能适应于实验室或实验室亚组变化或发展的角色。遗憾的是,这些适应有时可能达不到预期的效果。关于新的LIS的潜在缺陷,本文指出当实验室选择一个新的LIS处于特殊的位置时,需要考虑将实验室作为总体的需求与实验室各个单独部门的需求进行比较。LIS购买决策是重要金融投资,其有长期合同和明显的机构影响。这些决策的规模和复杂性可能造成某些独特的或低优先级的请求超过实验室或机构作为整体的业务需求。实验室内每个部门的需求通过单一产品通常是无法满足的。这可能导致实验室某些部门存在无法满足的需求。而且,应着重考虑LIS转换的挑战。虽然技术壁垒本身是困难的,但LIS转换还可能受到来自人员观点和组织文化变革管理的挑战。机构规模越大,替换业务基础设施的主要部件的挑战也越大。关于由于不断发展的技术所造成的缺陷,本文指出某些临床实验室分析仪最初是为研究工作而设计的。这些仪器可能包括它们自己的软件,其设计用于与其仪器进行交互作用。然而,该软件可能没有很好的开发选项用于与传统的LIS或电子病历(EMR)系统接口。这些独立的系统本身就可以认为是一个专业化的LIS。当供应商重点关注硬件时这种情况是比较常见的,因此,伴随仪器的软件就有待发展。这类系统更难以维护,而且可能需要专家现场来处理定制化及技术支持问题。关于源于非传统数据集的缺陷,实验室检测是一个快速发展的领域,每年有大量新的试验和技术引入到该领域。基因测序和分子检测可产生庞大的数据集,其需要定制的存储和数据处理解决方案。传统的LIS并非设计用于处理这些数据集。即使是如全切片影像系统的技术,可以创建一个专业化LIS的需求。大多数的全切片影像系统都有自己的软件,在许多情况下,它符合专业化LIS的定义。关于LIS如何满足独特的需求,本文写道很多情况下实验室可能对LIS有独特的需求,这种需求是当前使用的LIS无法满足的。如果实验室的需求过于独特,那么解决这些需求的软件市场可能很小。另一个有相似需求的实验室也可能有足够的需求差异,使得设计广泛的市场解决方案变得困难。从软件设计的角度来看,这些站点到站点的差异导致了市场的碎片化。由于这些确切原因,大型LIS供应商可能会避开小的利基市场。专业化的LIS供应商从小型客户群中获得足够的收入,以克服高昂的开发成本。如果需求或盈利能力足够强大,一些厂商可能愿意冒风险开发定制软件。本文提出建立内部LIS模块考虑的要素包括:可扩展性和及时性、设计团队的经验、支持成本、成本与效益等。关于可扩展性和及时性,最初,内部LIS模块的开发是为了优化工作流程。如果实验室后来决定增加额外的检测模式或工作流程,可能需要建立一个单独的模块。这可能是一个缓慢的开发过程,可能会延迟实验室进入一些检测市场。许多商品化的LIS已经有了可以满足附加模式的一般需求的模块。因此若已有这样的商品化的产品,则这些新模块将更快地得以应用。如果没有可接受的产品,则内部开发可能比等待供应商的解决方案更快。关于设计团队的经验,LIS不仅仅是一种软件产品。它是患者诊断信息存放地,其对组织使命有着至关重要的作用。此外,在美国的LIS还受到美国临床实验室改进修正法案(CLIA)和其它认可机构的广泛的监管。设计团队必须熟悉这些限制条件并也能与他们合作。设计团队需要配备相关人员,这样可以保护组织不受一个或几个关键人员的流失的影响。定制的解决方案可能需要一些人都来理解。拥有这种智力资本的退休或离职员工可能留下一个难以填补的知识空白。广泛地收集资料并使用通用的编码语言和通用的后台架构可能有助于避免重大的知识缺口。关于支持成本,内部产品必须在项目开始前将长期维护的成本考虑在内。现成的LIS产品通常是可预测维护成本。对于大型实验室,对商品化的LIS的年度维护费用每年可能超过几十万美元。开发一个新系统所需的员工可能远远超过支持这一系统所需的员工。在完成项目开发阶段后如何重新分配人员是一个需要思考的问题。对于新的技术和报告选择,本文介绍了离线LIS和报告结果给客户两方面。关于离线LIS,基于Web的LIS是比较新的,还没有被广泛的应用。基于Web的LIS的工作流程非常适合于集成的或增强的结果报告。一些比较大的商业化的实验室已经开始应用基于Web的LIS。在某些方面,有门户网站的大型商业实验室为其客户充当专业LIS。这非常适合于流式细胞术报告、分子报告、细胞遗传学报告和深奥的试验。基于Web的报告根据市场条件和客户类型可能呈现出几种不同的形式。对于参考实验室,其客户包括医院、医疗团体、医生、甚至是患者。基于Web可以下载一份完整的图像的PDF报告。然后,客户将这些图像报告展示给患者。将基于Web的结果与现有的LIS整合存在某些技术上的挑战。首先,基于Web的报告可能生成一个独立的数据流,这对于追踪待检项目的状态有一定难度。其次,结果传递的格式不太利于与当前的系统进行整合。许多现代化的解剖学LIS具有将外部文档附加到现有登录号的能力。这对于将各种结果和数据源集成在一起有很大的优势。有些LIS和EMR通过扫描允许图像元素的输入,附上一个电子文件如PDF或使用HL7(Health Level Seven)的临床文档体系结构(CDA)。关于报告结果给客户,对于基于Web的结果报告,报告组的设计是一个重要的考虑因素。考虑基于Web系统的许多个人用户可能属于同一客户,可以更清楚地理解此种情况。个人用户也可共同负责患者结果。建立报告组时应允许单个用户看到组内其它成员的结果。一般而言,报告组中的更多成员可能以牺牲安全为代价获得便利。不管如何分配报告组,每个用户应有唯一的用户名和密码。另外本期还刊登了本刊顾问冯仁丰老师的《为了体外诊断目的以免疫检测方法检测蛋白的溯源性至共同标准》。冯仁丰老师写道,近来,美国《临床化学》杂志刊登了Dr Miller的社论。他兴奋地宣布,一致性的时代已经到来。这个消息确实令人振奋。因为长期以来,促甲状腺素(TSH)的检测结果在各个公司的产品间的比较可比性很差,公司间对患者样品检测TSH的差异可以达到CV 30%以上。如何提高这个检测项目的一致性一直是大家在努力的目标。Dr Thienpont与她的合作者勇敢地承担了IFCC提出的甲状腺功能检测标准化工作组(WG-STFT)的任务。她们努力了多年,在近几年连续发表研究文章,展现了她们不断地为实现各个公司TSH产品对患者样品的检测结果逐渐趋向一致而做出的努力。冯仁丰老师将自己的学习体会写成文章,期望大家阅读后,可以更深入地了解他们实现一致性的努力。本文首先对计量学的基础定义进行了重新厘定。然后对促甲状腺素标准化的现状进行了综述。指出世界卫生组织很早就从人尸体的脑垂体中提取了人促甲状腺素(TSH),于1983年制成标准物质供全球使用。因此,各个公司购买这个WHO IRP 80/558的TSH标准物质,作为公司检测TSH产品的一级标准。通过溯源性传递的过程,使他们的产品具有校准品。可是,正如Dr Thienpont的实验结果所显示的那样,存在于患者新鲜血清样品内的TSH,与从脑垂体纯化的TSH在免疫检测上有着显著的差异。关于促甲状腺素在人样品中的复杂多态性,Dr Thienpont引用了Bergendah等的综述中对黄体化激素(LH)的多态性进行的详细分析。血液中TSH的情况,与LH极其类似。综述介绍了血浆内促黄体素(luteinizing黄体化激素,LH)的检测良好地遵循了计量原则,但是忽视了非均相糖蛋白(glycoprotein)有着广泛的转译后的多态性。在血浆内,LH存在一系列的分子同种型,有修饰的糖基化(glycosilation)、甲硅烷基化(silylation)和硫酸化(sulphation)模式的形式。存在于血浆的第一个LH序列,与WHO物质的LH十分不同,WHO物质含有的是高度纯化的人脑垂体的LH。另外,LH分子非均相随内分泌状态而异,在健康和疾病状态之间以及个体间也均不同。这个病理生理的异质性的原因是多态变异体由β-亚单位基因的点突变所致;在痴呆男性和卵巢缺失的绝经后女性中,发现典型的“特级”甲硅烷基化(较多酸性)同种型;在多囊卵巢综合征的患者中有较多的碱性同种型等。由于上述表现普遍发生在其他类似蛋白,总结指出,为体外诊断目的检测生物体液内的激素蛋白,是“混合物分析”。因为这样,严格的计量原则不可应用,报告的数量如上述促黄体素的5.0 IU/L会没有意义。而且直接使用WHO的国际参考制品(IRP)作为所有公司持续使用的一级校准品,无法使公司产品对患者样品的检测结果实现溯源性。对于进行TSH标准化实现一致性的前提,首先是认识患者样品的复杂性。临床实验室需要对新鲜患者的样品得到可靠结果。但是由于进行TSH检测血清样品内TSH的复杂多态性,被IFCC工作组认定TSH对血清样品的检测分析是对TSH的混合物分析。为此,所有检测结果的可靠性,必须自始至终以患者样品作为一致性的实验对象和依据。其次是使用真实患者样品传递检测结果可靠性,现有的WHO的国际参考制品(IRP)确实是国际上仅有的参考物质,目前各个公司只能以此校准公司的检测系统。但临床实践充分说明这样的标准物质没有带来一致性的结果,从溯源性链来说却又少不了这个唯一存在的标准物质。为了实现各个公司产品间对患者样品检测结果的一致性,最佳做法是,在公司第一次对检测系统的校准品定值中,只能采用WHO的IRP 80/558,作为实现检测系统对患者样品检测结果的溯源性依据。但是,在整个实现一致性的实验过程中,必须永远以真实患者样品作为检测结果传递的依据。因此,如何确定每次这样的检测结果可靠性传递的血清样品检测结果可靠性,这是关键所在。第三是以免疫检测程序应识别在TSH的不变肽序列上的表位,定义准替代成分混合物。各个参与一致性研究的THS产品公司对TSH检测使用的抗体位点有差异,这是造成各个公司检测结果不一致的重要原因。因此必须确认,参与一致性研究的各个公司TSH产品中免疫反应位点是否在TSH不变肽链序列上。这将是该公司产品是否继续被列入一致性研究的重要鉴别条件,不符合这个要求的产品将被淘汰。这样,尽管各个患者样品内的TSH多态性很复杂,但是只要公司的检测抗体可以捕获TSH蛋白的不变肽链上的序列抗原决定簇,那么实现不同公司检测结果的可比性就成为可能。这样的决定簇位点也就相当于真正的“参考物质”了。第四必须认真选择进行一致性实验的患者样品。临床实验室每天进行检测的样品来自各种患者。各种疾病和接受药物治疗等因素均会严重影响甲状腺功能的检测。为了尽可能减少每次比对使用的样品中各种因素对TSH检测结果的影响,必须非常重视样品的选择。Dr Thienpont还专门写了文章《好样品才能得到好的检测结果和结论》。简言之,造成患者甲状腺功能亢进或衰退的生理和病理原因并不简单,对甲状腺功能不正常患者的治疗也比较复杂。为了使甲状腺功能正常、亢进和衰退的样品都可以实现一致性,这些样品都应该进行实验。但是实验必须分步实施。实验使用最多的是正常甲状腺功能的样品,开始评估结果一致性应从正常功能入手;而且逐步开始进行功能不正常样品实验时,还必须从已经实现一致性的正常样品那里将一致性可靠性传递给各个公司的检测系统,然后再去检测概念不正常的患者样品。所以IFCC的TSH一致性工作组收集的功能正常样品,每个供体必须提供至少400ml以上的血浆。接着再收集甲状腺功能亢进和衰退的患者样品,可以少一些,但困难非常大。不论怎样,IFCC工作组还是克服了困难。在收集样品过程中,IFCC工作组尽力排除来自各种因基因突变导致甲状腺功能不正常的患者的样品,对使用基因重组的TSH生物制品进行治疗的患者样品也不予考虑。除此之外还有一些对收集样品的患者的要求。总之,收集符合实验要求的样品是开展实验工作、得到可靠结果的第一前提。第五是整个实验分阶段实施。大致上IFCC工作组的实验分为4个阶段。这项被称为“一致性的递升方案(A”Step-Up”approach for harmonization)”工作的第一阶段为“熟悉阶段”,该阶段将按照设计方案,对一致性的候选被测量进行实验。如果实验结果具有足够的质量,实验成功了,那么再进入第二阶段“递升阶段”;如果不成功,将作出终止决定,为改进给出建议。在递升阶段,观察在TSH的病理生理浓度范围是否实现充分的一致。若是,则可进入第三阶段“一致性阶段”;如果在第二阶段没有成功,则必须终止实验,研究改进。在第三阶段得到了一致性的结果,说明IFCC工作组的实验方案成功,使方案的做法对甲状腺功能正常、亢进和衰退的TSH结果都实现了良好的可比性。说明患者TSH的检测结果在各个公司的检测系统检测下实现了一致性。这次,美国《临床化学》杂志刊登的Dr Thienpont文章,叙述了IFCC工作组进行了递升方案的第四阶段“实现不同公司检测系统的TSH检测结果,具有相似的参考区间”。这项工作刚刚发表,就引起了全世界检验同道的热烈反应。第六是采用所有检测程序患者样品检测结果的修整均值,为传递结果可靠性的最重要手段。经过实验结果的统计分析,Dr Thienpont的团队采用了稳健原则成分因子分析,得到各个患者样品的所有检测程序的修整均值。这样,每个符合要求的TSH检测产品对每个样品的检测结果,经统计处理后得到的所有程序的修整均值,使各个公司以这样的样品以及它的修整均值作为上一级“参考物质”去重新校准它们产品的检测结果。最后TSH检测结果最后必须以SI制形式报告,这是真正实现患者样品检测结果达到可比性的重要度量。由于患者样品内TSH多态性的复杂程度,可以想象同一个TSH名称下,不同大小、与各种糖形结构的组合等,每个TSH的分子都不一样。因此表达这样混合物内TSH的量的多少最科学的做法就是应该以mol/L表示。可是目前还无法进行以WHO IRP标准计算获得的IU/L与mol/L结果的换算。因此,实现了一致性的各个公司现在报告的IU/L的意义与原先的单位在含义上已经完全不同了。正如前述,这样的检测结果IU/L,完全依赖真实样品的不断比对才得到的可靠结果,已经几乎脱离了原WHO IRP的标准传递的量值,这才是以后对于诸如TSH项目所需要的。


在《妇幼诊断》专刊中,刊登了北京医院、卫计委临床检验中心王治国、叶圆圆的文章《新筛儿干血斑溶酶体酸性α-葡糖苷酶活性测定筛查庞贝病(Pompe病)》。文章首先概述了PD的生物学和临床特征,接着介绍了用酸性α-葡糖苷酶活性试验检出PD的方法。指出所有的GAA功能检测测量的是人工基质的转化产物,这种转化产物通过荧光光谱法或串联质谱法(MS/MS)可检测出来。所有试验的活性单位是每一孵育小时单位体积样品产生的产物的摩尔量,一般表示为μmol/L/h。测量的活性水平取决于基质结构和孵育条件,最重要的是pH、时间和温度。样品量取决于洗脱的DBS孔的大小和孔中指定的血量,试验中用的是洗脱的量。关于96微孔板荧光分析,这一程序从以前的荧光法修改而来,其使用描述为PD新生儿DBS筛查程序。进行以下试验:GAA活性,在pH为3.8且有阿卡波糖存在时测量;总酸性α-葡糖苷酶(tGAA)活性:在pH为3.8且无阿卡波糖存在时测量;中性α-葡糖苷酶(NAG)活性:在pH为7.0且无阿卡波糖存在时测量;tGAA活性反映了同工酶GAA和麦芽糖酶的联合活性。tGAA活性用于计算可被阿卡波糖抑制的活性的百分比,计算公式为抑制%=(tGAA-GAA)/tGAA。NAG活性通过计算比值=NAG/GAA来控制DBS的量(纠正样品稳定性和白细胞计数)。其它酶可用于替代NAG,但Fabry病所缺乏的α-半乳糖苷酶(GLA)不可以,其有效性较低,可能是由于低GLA样品较多。由于基质背景荧光和血红蛋白荧光猝灭变异,应使用一个空白对照。从一个3.2mm的孔中洗脱的洗脱液经自动移液系统分配到6个板上。PD新生儿DBS筛查可使用两级检测策略来降低假阳性率,尤其是在GAA假缺乏等位基因p.G576S有高发生率的人群中。首先,从一个DBS打孔中进行GAA和NAG活性的双重检测从而计算NAG/GAA活性比值。缺乏GAA活性但有足够的量(表现为NAG/GAA比值显著升高)的DBS可进行确证试验(筛查阳性的结果)。GAA活性部分缺乏但有足够的量(表现为NAG/GAA比值轻微升高[不确定的结果])的DBS需再次打孔并进行第二级的三重检测(GAA、tGAA和NAG活性)。抑制百分比高可视为筛查阳性,随后应进行确证试验。关于数字微流控荧光分析,DMF分析已被用于新生儿酶活性降低或缺乏的筛查。DMF方法是以一种仪器为基础,使用专利技术来评估从DBS中提取的样品的酶活性。酶活性结果显著降低说明需要进行新生儿临床评价和确证的诊断性试验。


DMF技术是以电润湿效应为基础的。在液体-固体界面施加一个电压以有效降低界面张力,导致以一恒定角度发生变化。这一技术可用于操纵液滴至一排独立可控的表面电极。每个样品液滴在样品盒中经过运输、融合、分离或分配。所有液体都电动操作不需要任何泵、阀或通道。通过常规的NBS处理过程从DBS标本中打下3.2mm 孔的样品进入微孔板。每个滴定板都有样品(N=40)和对照(N=2)。在室温下从DBS打孔中提取30分钟,将3.5μL的等分样品转移进DMF箱中。每个DMF箱中配置4个校准质控品、低水平和中水平的DBS质控品。DMF平台软件协调所有样品处理过程并使样品液滴在适合的试剂条件下孵育一个小时。然后将样品液滴输送到DMF箱中的特定位置,在这一位置进行荧光测量,荧光测量的物质是活性酶对人工基质裂解生成的游离4-甲基伞形酮化合物。软件将荧光数据转换成每个样品产生的酶活性数据,并对活性低于预定的截断点的进行标记。DMF可稳定地整合进DBS样品处理系统并在NBS实验室内运行。从打孔到获得检测结果大约需要4小时,每台仪器每天可进行两个批次的检测。在一个液体通道从相同的DBS洗脱液中可检测5种不同溶酶体酶的活性,从而在一次DBS打孔中筛查多种疾病,并可以比较彼此间的酶活性以评价样品完整性和疾病风险。每个DMF箱可以检测40份样品,每个DMF平台上一次只能运行一个DMF箱。高通量筛查需要多个DMF平台。关于流动注射分析-串联质谱分析,20世纪90年代末将串联质谱技术引入NBS,当时NBS遵循一项试验一种疾病的模式。由于串联质谱可以同时测量多种被测量,使NBS增加了从一个DBS打孔中检测的代谢障碍的数量。在流动注射分析应用中,将样品注射进流动相中,通过电喷射离子化,用三重四极杆质谱分析(见CLSI文件NBS04)。使用液相色谱(LC)泵传递流动相,但不需要色谱分离。由于流动注射分析-串联质谱分析(FIA-MS/MS)法的高通量、特异性和多重性能特点,其在常规NBS中已经得到广泛运用。通过测量酶促产物可用这一方法筛查溶酶体酶缺陷。FIA-MS/MS检验前通过液液萃取(LLE)或固相萃取(SPE)移除盐和清洁剂。因此,LSD试验比当前使用的常规NBS MS/MS筛查试验更复杂。用于单个LSD新生儿DBS筛查的MS/MS检测的发展先于直接的多组分检测的发展,DBS筛查的疾病包括PD、克拉伯病、尼曼匹克病A/B型、戈谢病和法布瑞氏症。最初的方法中,一个5mm的DBS孔在80μL缓冲液中水化。对于GAA反应,10μLDBS提取液与15μL包含酸性柠檬酸磷酸盐缓冲液(Ph4.0)、GAA基质、内标、干扰酶抑制剂阿卡波糖和去污剂的混合物混合。其它4个酶的反应体系的建立方式与此相同。这5个反应分别在5个独立的孔中同时孵育过夜,这5个孔分别具有每种酶特异的最佳缓冲液条件、基质、内标、去污剂和抑制剂(有需要的话)。然后将这5个孵育所得的反应产物混合到一个孔中,用LLE和SPE处理去除盐、去污剂和多余的基质。再用FIA-MS/MS分析这个混合的样品以测量这5个反应同时产生的酶产物和内标。单独筛查PD时,一个2mm DBS孔直接与25μL如前所述的检测混合液混合孵育然后用FIA-MS/MS分析。过去几年对FIA-MS/MS检测的完善和改进做出了很多努力,当前的检测已经可以筛查MPS I。这种检测在单次检测混合液中将一个3mmDBS孔与所有的基质和内标共同孵育。孵育后经LLE处理,然后用FIA-MS/MS分析。这一最新的筛查方法可用于检测以下LSDs中的任何一个,单个或联合疾病:PD、克拉伯病、尼曼匹克病A/B型、戈谢病、法布里氏症和MPS I。所有的内标对于相应的酶生成产物在化学性质上是相同的但为氘化同位素。这种方法中,所有酶产物通过一个化学性质相同的内标进行定量,这个内标经历与产物相同的过程(如被酶分解、与基质结合、在质谱的电喷射离子化中抑制)。有一些实验室已经发展出他们自己的MS/MS检测以筛查PD和5种其它LSDs(克拉伯病、尼曼匹克病A/B型、戈谢病、法布瑞氏症和MPS I),可以检测单个疾病也可以多个疾病同时检测。关于液相色谱-串联质谱,首先是引入液相色谱到串联质谱。在DBS中完成以质谱(mass spectrometry,MS)为基础的LSDs分析通常使用FIA-MS/MS。然而近几年出现的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测成为另一可行的选择。由于其灵敏性和选择性,目前LC-MS/MS可用于某些诊断性检测和作为NBS的第二级检测。这一方法相比于FIA-MS/MS更具优势,包括降低劳动力密集的样品处理工作、提高了灵敏度、减轻了交叉被测量的离子抑制。而缺点在于样品两次注入间的时间延长了:LC-MS/MS为2.5分钟而FIA-MS/MS为1.5分钟。但对于拥有在HPLC仪器维护和操作有经验的员工和资金支持的实验室而言,更喜欢使用LC-MS/MS。LC是一种从液相样品组分中分离出混合物的分析技术。分离是由于不同组分与固定相LC柱的反应不同。每种组分与固定相间的特殊反应用一个术语“保留时间”来表示,其对特定的LC条件是独特的(如流动相、梯度、固定相)。推荐使用选择反应监控(SRM)的数据获取模式。色谱产物以高斯型的峰表示,为信号强度随时间的变化,而在LC-MS/MS中,信号则为SRM跃迁的强度。LC-MS/MS的优势在于灵敏度改善、样品工作量减少或简化以及特异度维度增加(保留时间)。缺点包括物质损耗(如柱、流动相的溶剂)、与FIA-MS/MS相比批次间时间更长(包括下一批样品前的柱平衡时间)和需要有经验的人员来操作和维护仪器(见CLSI文件NBS04)。使用LC-MS/MS进行LSD分析的最大优点在于在MS/MS分析前不需要进行样品清理。当前的FIA-MS/MS程序需要LLE以清除极性样品组分,其中有一些程序使用SPE清除过多的基质,这两种方式都会对MS/MS分析造成明显的信号抑制和干扰。已经有证据证明在不使用经典的LLE和SPE步骤下使用LC-MS/MS测量GAA和DBS中的其它溶酶体酶的活性。使用这一方法分析了5000多个DBS证明有足够的日间和日内精密度(分别为1.3%-6.7%和5.4%-15.7%)。这个研究证明使用LC-MS/MS进行LSD分析对于NBS实验室是一个可能的应用。另一个研究使用更现代的仪器,使用超高效液相色谱(UHPLC)而非HPLC进行色谱,使用4个柱子和多个阀交错注入样品显著降低了样品-样品间的时间。这一研究之后发布了一个新生儿DBS的大数据集(N=8600),证明了使用该方法可高通量筛查GAA和其它4种溶酶体酶活性。相同的研究小组使用该方法筛查了34736新生儿DBS的PD、戈谢病、法布里氏症和尼曼匹克病A/B型。对15个样品通过突变分析证实了筛查结果,包括4个确诊的PD。使用LC-MS/MS进行LSD分析时使用多组分孵育缓冲液进行修改且分析时不再使用在线清理柱。使用含有3种基质和内标的多组分孵育缓冲液进行一个DBS孵育,与参考方法进行对比,这需要事先提取和分离并在分析前将样品混合注入单独的孵育孔。去除这一过程便不再需要多个孔板和缓冲液,极大地简化了样品孵育步骤。同时使用这一方法不再需要废弃样品在线清理;整个样品直接注入柱子中。这一方法扩展到UHPLC和多组分孵育缓冲液以检测DBS的GAA和其它8种溶酶体酶缺陷。由于UHPLC-MS/MS的灵敏度增加,一般的孵育时间(在37℃下轻微晃动时约20小时)可缩短至4个小时。需要进行进一步研究以确定孵育时间缩短是否会影响灵敏度。这些例子证明对于LSDs的质谱分析,LC有助于减轻冗长的费力的样品处理程序(如LLE和SPE),缩短孵育时间,改善灵敏度和在不牺牲通量的前提下消除交叉被测量的离子抑制/干扰。尽管具有这些优势,LC的应用需要有技能的人才以及购买和支持仪器使用的资金。然后是超高效液相色谱-串联质谱法筛查PD和其它溶酶体贮积病。伊利诺斯州立法要求为6种LSDs NBS建立MS/MS检测,包括PD,研究于2011年开始启动。这个多组分检测是以已发布的方法为基础的,但使用一种含去污剂的缓冲液以适应疏水和亲水的基质。孵育3个小时后用前述的方式通过UHPLC分离孵育后的产物。然而为了降低成本、复杂性和仪器维护,使用一个带阀的柱子以在样品注入前去除低分子量物质及样品注入后去除去污剂、磷脂质和没有发生反应的基质。样品-样品间的时间为2.5分钟,每天每台仪器可完成500多次样品注入。还讨论了NBS检测PD和其它LSDs的分析中质量控制的一般考虑因素,如内部和外部质控品、人群数据监控、定量酶反应值对分类结果的影响、能力验证、确证的阳性标本库、试剂批次改变质控、仪器匹配、标本和样品质量等。对于使用干血斑参考物质进行分析质量控制,本文指出由于DBS标本基质的独特属性,应使用DBS-RM连续监控、评价和检查定量NBS检测方法。DBS-RM对于发展和确认实验室NBS检测方法也很重要。在检测发展和常规QC中,除了校准参数外DBS-RM还提供了一个检测性能的二级评价。确诊为PD的新生儿的剩余DBS对于实验室而言是非常有价值的参考物质,应尽可能保存在最佳保存条件下,在实验室内或实验室间进行特殊评价时少量使用。还描述了DBS-RM的代替品,从足够大的样品池中制备以为长时间的实验室内和实验室间评价提供足够的样品。这种物质可由NBS实验室自己制备,或由外部机构制备PT样品。从PD成年人样品中制备的DBS也是很有价值的参考物质,这比新生儿DBS更容易获得。然而,当PD患者经受ERT时,应在下一次ERT前采集外周血液样品。应确保这些样品的GAA活性缺乏,其它相关的溶酶体酶活性在预期范围之内。本文最后还讨论了选择和实施实验室试验进行PD新生儿DBS筛查的一般考虑因素。提及了预算和管理要求。

在《微生物与感染》专刊中,刊登了北京医院、卫计委临床检验中心王治国、李婷婷两位的文章《ELISA定性试验室内质控及数据的实验室间比对管理》。本文详细研究了使用控制图连续评价各个实验室的检测过程并提供外部监测数据的方法。数据基于D.E.Rebeski等人的文章《图形方法监测ELISA法检测锥虫抗体的操作性能》(Veterinary Parasitology,2001,96,11-50),文章给出了在不同国家的15家诊断实验室中使用四种间接ELISA法性能的详细案例。研究表明使用图形方法评价每种ELISA性能的实际用途。用于评价ELISA有关预期的上限和下限的性能指标的标准化的室内质量控制(IQC)样本数据由试剂盒生产商的研究确定(暂定值)。基于原始(光密度)和标准化吸光度值(计算为对照阳性的百分比),通过绘制值的位置和偏差的图形估计与期望数据范围值的分散。此外,通过绘制IQC中变异系数<10%的分布图来估计试验的不精密度。计算不同质控品的结合率来估计关于评估IQC样品在测试中是否检测出阳性或阴性正确度的检测能力。吸光度值离散图形分析结合试验的不精密度和能力标准对ELISA操作性能进行评价被认为是满意的,并为每板的可接受和拒绝提供有用的决策标准。对间接ELISA法建立标准化和易懂的IQC数据图法为国家实验室报告疾病发生提供了更强的信心。而且,利用数据汇总图并参照描述的性能标准检查所有实验室间的相对性能。也可以利用改良的Youden图分析检查IQC数据,并证明间接ELISA法可成功应用于诊断实验室,用于监测锥虫病控制计划。已经建立了四种间接ELISA法,也对其稳健性和诊断性能进行了评价。另外,已经开发了标准化的易懂的用于监控ELISA的操作性能是否处于指定的限度内的控制系统,并将其应用于热带地区的诊断实验室。研究目的是通过使用图表方法获得用于检测锥虫病抗体的四种ELISA方法的质量控制数据。对于在实验室开发阶段确定的暂定控制数据范围,这种方法确保了持续控制和监测ELISA法的操作性能。数据是从标准的IQC样品中获得的,并使用休哈特样图处理。这些方法提供了即时的可视化的监控,并有助于控制每个板之间和每天的操作性能。在不同国家的15个实验室之间比较了试验的整体操作性能。使用汇总数据图和改良的Youden图对结果进行图形分析。


在《精准医疗》专刊中,刊登了北京医院、卫计委临床检验中心王治国、段敏两位的文章《欧洲基因检测实验室的质量管理与认可方法》。基因检测的质量要求特别高,因为该检测通常仅在患者的一生中进行一次,因此增加了错误的潜在危害,并且结果不仅对被检测的个体,也对其亲属产生重大影响。许多组织,包括囊性纤维化网络、欧洲分子遗传学质量网络和欧洲科学技术瞭望,都强调需要提高欧洲基因检测服务的质量和一致性。另外,经济合作与发展组织(Organization for Economic Cooperation and Development,OECD)分子遗传检测质量保证指南的目的是提高质量,该指南建议“实验室报告用于临床医疗目的的分子遗传检测结果应该获得认可或者得到同等的承认”。由于这些因素,在欧洲许多国家,基因检测实验室的认可正从“推荐”转为“要求”。为了支持实验室进行认可并提高对质量保证的理解(QAu),在EuroGentest卓越网络的框架下(EUGT NoE,FP6-512148,http://www.eurogentest.org),开发交互式专题讨论会。通过整合实验室和质量管理方面的专门知识,以及学习和变革管理,取得了成功的模式。主题包括认可、质量保证理解、内部审核、诊断确认、室内部质量控制(internal quality control,IQC)、室间外部质量评价(external quality assessment,EQA)、管理评审(management review,MR)、软件支持质量体系(quality systems,QS)和变更管理。专题讨论会为实验室提供了一个独立的论坛,以分享经验,并学习开发和完善质量管理体系(quality management System,QMS)。此外,提供国际专题讨论会有助于推进整个欧洲质量管理体系的一致化和认可方法。本报告旨将不同专题讨论会的成果结合起来,其目的是为基因检测实验室质量管理体系提供指导和介绍。因此,首先了解专题讨论会的组织、参与者和方法。第二,根据国际标准化组织(ISO)15189的原则,对QS的关键方面进行处理并提出建议,具体强调实际的实施和现实生活的实例。


实验室质量控制永远是《临床实验室》最重要的专题之一,也是IVD的核心所在。


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