检验技术“百科全书” —— 技术导航回顾

发布时间:2017-12-01       作者:DDM       来源:临床实验室        浏览:1811       收藏: 0

在《生化》专刊中,《胱抑素C用于肾小球滤过率估计:日趋成熟》一文指出,与肌酐相比,胱抑素C受肌肉质量的影响较小,对于估计人群亚组的测定GFR来说通常比肌酐更准确,包括素食者和肌肉萎缩、慢性疾病或截肢患者。胱抑素C的非GFR决定因素并不广为人知,基于胱抑素C的eGFR(eGFRcys)在常规GFR估计中并不比eGFRcr更准确。结合肌酐和胱抑素C的eGFR(eGFRcr-cys)比基于单独一种标志物的eGFR更准确,反映了同时使用两种标志物时,任一标志物的非GFR决定因素的影响更小。eGFRcys在预测预后上比eGFRcr-cys或eGFRcr更准确,可能表示这些标志物的非GFR决定因素的影响正相反(例如,肌肉萎缩导致血清肌酐浓度更低而炎症导致血清胱抑素C浓度更高)。肌酐和胱抑素C都有标准化参考物质,慢性肾病流行病学协作组(CKD-EPI)建立了标准化肌酐和胱抑素C的估计方程。现行的临床实践指南推荐使用CKD-EPI 2009方程作为初始测试测量血清肌酐和报告eGFRcr,使用CKD-EPI 2012方程作为确认试验测量血清胱抑素C和报告eGFRcys和eGFRcr-cys。每种滤过标志物(或组合)使用单个方程有利于广泛实施eGFR报告,但是如果其它GFR-估计方程比CKD-EPI方程更准确,也推荐使用。肌酐通常在急性和慢性疾病中测量,美国90%的临床实验室会报告eGFRcr。更广泛使用胱抑素C的限制在于,虽然在大规模的临床人群中引进了CKD-EPI 2012方程的标准、少数评估,但是商业试验之间仍缺乏一致性,而且对胱抑素C的非GFR决定因素的理解不全面。Grubb等人在同一期的《临床化学》杂志上对解决前两个问题取得了重大进展。Anders Grubb及同事在该领域获得了里程碑式的成就。最近,Grubb带领着胱抑素C标准化工作组(WG-SCC,由国际临床化学联合会及参考物质和测量研究所成立的)建立了参考物质。本文有两个目的,提高商用试验之间的一致性和建立不依赖所用临床胱抑素C测量程序的新GFR估计方程。为了实现第一个目标,WG-SCC与7家诊断公司合作来评估6个试验(其中2家的试验相同)。使用线性回归来研究在800-1000份血浆样本或10个血浆库中6个试验的定值(assigned value)的关联。相关性非常好(R2=0.993-1.000),但是比较存在异质性(heterogeneity),斜率系数在0.932-1.058,截距系数在-0.1105-0.0388。经过调整后胱抑素C最高和最低定值之间的eGFRcys差异被认为可忽略不计(与均值相比约为5%)。本研究的一个主要优势在于表达了测量程序之间存在差异并且临床实验室胱抑素C测量程序之间需要一致化。理想上来说诊断公司将利用这一信息校准他们相对于国际标准的测量程序,这样使用标准化胱抑素C的方程估计GFR才能真正与试验无关。至于第二个目的,Grubb等组合了3组4960个体的mGFR和胱抑素C的浓度数据 [3495名瑞典成年人、763名日本成年人、和702名瑞典和荷兰儿童,简称为CAPA(Caucasian and Asian pediatric and adult subjects)]。每组以不同方法测量GFR;2组使用了较研究更适合临床使用的1个样品血浆清除率方法。胱抑素C的检测使用了不同方法,但如第一个目的那样,以回归统计进行调整。以随机选择了三分之二的研究群体的样品形成了新等式,再以余下的三分之一的样品进行内部确认,并与CKD-EPI 2012的胱抑素C等式进行比较。新等式包括年龄、血清胱抑素C的单一系数(指数)(-1.069)、和胱抑素C肾外消除率 [在GFR范围内7ml·min-1·(1.73m2)-1]。相反,CKD-EPI等式是以北美和欧洲的白人和非洲-美国成年人形成的,包括血清胱抑素C的2个系数(胱抑素C>0.8mg/L时系数为-1.328;胱抑素C≤0.8mg/L时系数为-0.499)。CAPA和CKD-EPI等式的性能在3个组内是等同的。二者等式,在组间的偏移和精密度不同,但准确度被判断都为可接受。作者推断,CAPA等式像CKD-EPI等式一样准确,但优选CAPA是因为它没有要求性别规定,而且考虑了肾外消除率。该研究的长处(优势)是包括了亚洲人以及白种人,也包括了儿童和成年人。不足之处是缺少其他种族和民族、GFR检测程序不一致、胱抑素C的肾外消除率是推断不是测量,最重要的是没有外部确认的人群。以某个外部人群证实任何新的估计等式,是确认准确评价真实要求的。Grubb等报告发现了CAPA人群内部确认数据库中CKD-EPI等式的性能,可以提供CKD-EPI等式有效性的有价值信息,但是没有提供CAPA等式有效性的信息。为了克服这个局限性,在研究人群中我们比较了CAPA和CKD-EPI等式,这些是用于形成和确认CKD-EPI等式的人群。在CKD-EPI外部确认人群中,2个等式的性能整体相当。但2个等式低估了测量的mGFR较高处;而CKD-EPI等式在具有mGFR为90~119ml ·min-1·(1.73m2)-1个体中的偏移较小,看来因为包括了血清胱抑素C浓度≤0.8mg/L的第二个系数。CAPA等式在男性与女性间的小差异,但在CKD-EPI等式中没有,表明CAPA等式中缺了性别要求弊大于利。CAPA等式在CKD-EPI内部确认人群中的评价揭示了相似发现。另外,在黑人和非黑人间的偏移没有差异。依据这些发现,除了Grubb等在本文中报告发现外,我们would conclude的结论认为,CAPA等式没有比CKD-EPI 2012胱抑素C等式更准确,我们相信它也不是eGFRcys等式首选的。另外,我们可推断,依据胱抑素C对GFR估计,可不要求规定种族(至少对北美和欧洲白种人、非洲裔美国人、或日本人),也不要求对成年人和儿童有不同的等式。进一步研究可有助于确认这些结论。我们相信胱抑素C已经走向成熟。实验室的检测正在改善,以胱抑素C估计的GFR等式具有广泛应用。我们建议,应更经常检测胱抑素C,应报告为eGFRcys;如果同时检测肌酐,应报告为eGFRcr-cys。避免了需要规定种族和被肌肉质量混淆,和更准确的预后是eGFRcys超过eGFRcr的主要优势。但是,在常规使用中eGFRcys没有比eGFRcr更准确,不了解胱抑素C的非-GFR决定因素和不降低检测成本,在不远的未来,我们确实预见不到在GFR估计的初始试验中,“新的”胱抑素C取代“老的”肌酐。目前,它最有用的作为一个确认检测,特别是与肌酐结合,此时依据二者滤过标志物的eGFR,同时提供较任一标志物有更大准确度。要求进一步研究去确定人群中的亚组,在他们中,肌酐的非-GFR决定因素导致eGFRcr的不准确,以及为这些亚组人群相应的诊断检测项目安排。为了更好地在临床解释eGFRcys,估计GFR和预后二者,要求确认胱抑素C的非-GFR的决定因素。最后,应继续研究另外的滤过标志物,由于使用组合的内源性滤过标志物具有使单一使用每个非-GFR决定因素为最小的潜在性,即使没有对每个标志物没有完全了解它们的非GFR决定因素。《基于胱抑素C和肌酐的估计肾小球滤过率比值可预测与肾功能无关的健康老年人死亡率》一文指出,胱抑素C/肌酐比率作为参与SENIORLAB研究健康成人大型集合死亡率的预测因素,这项研究鉴别出胱抑素C和肌酐的比率作为完成基准检查平均随访3.7±0.7年后发病率和死亡率的独立预测因素。但是,我们没有研究胱抑素C和肌酐的eGFR的比率是否与经过调整的模型的死亡率相关。简而言之,为了建立大型多样性实验室试验的参考区间,SENIORLAB研究包括60岁的健康老年志愿者和年龄更大的居住于瑞士的志愿者。经过一夜的时间,观测参与者的人体测量基准数据、病史采集数据和最佳分析前环境中的采血数据。立即使用超过100种不同的实验室试验对该样品进行测量处理。使用先前叙述的肾功能标志物和其他实验室试验,估计肾小球滤过率。在他处生成记录发病和死亡率信息的随访调查报告。这一研究的排除标准包括当前类固醇药物的使用情况、甲状腺功能失调(为了降低对胱抑素C浓度的非肾脏影响)、C反应蛋白浓度(CRP)超过10mg/L,以及体重不符合要求(体重指数[BMI]<18.5,为了降低对胱抑素C浓度的非肾脏影响)。SENORLAB研究是一项ISRCTN注册的研究(ISRCTN53778569)。此研究包括总数为1382名的主观健康参与者(平均年龄71.9±7.8岁;男性比例46.9%)。平均随访2.2±1.2年后,58名参与者(4.2%)去世。白种人、黄种人、儿童和成人人群(CAPA)和改进Lund-Malmo(LMrev)的胱抑素C和肌酐eGFR平均比率为1.2±0.19,CKD-EPI程式计算的比率为1.05±0.18。CAPA/LMrev以及CKD-EPI eGFR比率的斯皮尔曼等级相关便显出很强的相关性(r=0.93;P<0.001)。与随访期间去世的参与者相比,存活的参与者显示出更高的胱抑素C和肌酐eGFR比率,CAPA/LMrev(1.2±0.18 vs. 1.12±0.22;p=0.001)和CKD-EPI比率(1.06±0.17 vs. 0.94±0.20;P<0.001,滑动t检验)。多变量回归模型包括年龄、性别、结合胱抑素C(CAPA)和肌酐(LMrev)eGFR,胱抑素C和肌酐eGFR相匹配。无论肾功能评估结果(结合CKD-EPI或结合CAPA-LMrev)或胱抑素C和肌酐eGFR比率的计算结果,如何年龄、男性和与肾功能相反的胱抑素C与肌酐eGFR比率对死亡率具有显著的预测性。在这些模型中,eGFRCysC/eGFRCrea与死亡率呈负相关。在进行BMI平均动脉血压、心脏收缩压、舒张压、BNP、糖化血红蛋白、已知糖尿病、CRP、脉压、HDL或吸烟状况的调整时,增加1个额外的心血管风险因素到年龄、性别和调整的eGFR模型中,通过eGFRCysC/eGFRCrea率预测死亡率揭示了eGFRCysC/eGFRCrea率和总死亡人数之间的显著相关性仍然不变。总而言之,在调整的模型中现有的分析表明胱抑素C和肌酐肾功能评估(eGFR)比率是健康成人人群独立的总体死亡风险因素。该风险因素不会因使用CKD-EPI方法或其他评估肾功能或肾小球过滤质量指数的程式(CAPA、LMrev)而改变。这一结果与Dardashiti等人将eGFRCysC/eGFRCrea比率作为不同集合总体死亡独立预测因素的发现相一致。这一结果补充了我们将胱抑素C/肌酐比率作为健康成人人群死亡风险因素的发现。但是,胱抑素C与肌酐的比率或eGFRCysC/eGFRCrea的比率是否是鉴别变化着的肾小球过滤质量相关风险的更好的标志物仍然有待研究。当使用将死亡作为独立变量的逻辑回归模型时,年龄、性别、eGFR和肾小球过滤质量标志物都作为独立变量,我们的数据表明与eGFRCysC/eGFRCrea比率(AUC0.792,95%CI:0.769-0.813)相比,该模型胱抑素C/肌酐比率(曲线下面积AUC:0.793,95%置信区间,CI:0.770-0.814)的C统计不显著。但是,我们的研究没有足够的力量评估这两种肾小球过滤质量测量方法之间的区别。胱抑素C血清浓度和肌酐GFR计算的一个参数的优势是目前血清浓度可以使用标准模型评估。相反,肾功能评估独立于使用的程式,可能会为风险评估带来偏移。不仅如此,使用eGFRCysC/eGFRCrea比率作为肾小球过滤质量标志物可能使eGFR方程中的年龄产生混淆,而年龄正是这个方程中死亡和发病的只要预测因素。《尿白蛋白测量方法间的变异性》一文提到,尿白蛋白(uALB)是肾脏微血管疾病诊断和治疗有用的标志物,BecKman Coulter最近改良了他们AU系列设备uALB试剂的配方,改进了分析测量范围(AMR)。研究者使用AU680测定了配方改良试剂精密度、线性、可报告范围和分析灵敏度。此外,配方改良试剂与前一代AU试剂进行了比较,并使用残余尿液标本与Siemens Vista进行了比较。通过添加血清到白蛋白游离尿液中生成白蛋白浓度范围在5台仪器上评估了钩状效应。实验结果确认了AMR内的精密度和线性,连同稀释准确度扩大了可报告范围。对患者样品相关性而言,配方改良试剂表明:相对于初始的AU试剂,存在11%的正偏移;相对于Vista,存在11%的负偏移。uALB浓度>3000mg/dL,AU试剂产生假的低结果。DCA Vantage试验甚至在更低浓度的uALB时也会发生“钩状效应”。结论:配方改良的试剂符合制造商声称的性能。在评估的浓度范围中,仅AU和DCA Vantage设备受到了钩状效应的影响。uALB试验显然不标准,但是临床指南对结果解析做了规定。在uALB解析中,我们观测到的方法间变异性具有导致显著临床分析后错误的可能。本文还指出,配方改良的AU uALB试剂符合制造商标称的性能特征。和其他制造商的配方改良uALB试剂类似,主要目标是扩大AMR。基于2年的历史uALB结果(n=19945),uALB AMR从30上升到45mg/dL应该降低16%的执行机载稀释数量。同样的,超越分析仪机载性能标本的人工时数数量应该减少52%,这是提高高度自动化实验室结果质量和总体效率的重要因素。观测到的一个显著现象是:2种AU试剂间的偏移显然是通过QC材料和患者标本得到的。不同厂商方法的比较证明测量的uALB浓度存在差异。相对于原始和配方改良AU试剂,Siemens Vista证明平均正偏移分别为~21%和~11%。uALB试验显然不标准,目前既没有参考材料又没有参考测量程序。建议根据临床决策点进行结果解析。由于尿白蛋白排泄是典型的纵向监测,一系列非标准试验的uALB测量能改变疾病预后的分析,并潜在导致临床管理活动的不当更改。实际上,即使在我们用于方法比较的小型患者样品集合中,4%的样品会因使用原始AU试剂被分为中度蛋白尿(30-300mg/g肌酐),因使用配方改良AU试剂被分为严重蛋白尿(>300mg/g肌酐)。比较使用2种最不相同的试验原始AU试剂和Siemens Vista试验生成的结果时,患者样品归类发生变化的比例会翻倍达到8%。一项涵盖超过2000名普遍健康实践者的国际调查表明尿白蛋白中值33%的变化会被视为具有临床重要性。我们观测到的方法间偏移,在结合分析不精密度和个体内变异时,能导致uALB解析的分析后错误。国家肾病教育计划(NKDEP)和国际临床化学联合会(IFCC)正在为标准化尿白蛋白测量而努力,并将改进CKD评估的效果。钩状效应是正确uALB定量和随后临床解析存在的潜在问题。免疫比浊和免疫比浊测定试验在抗原过量时结果出现的假性偏低倾向已经被大范围的生理常数如uALB广泛记录。在uALB浓度大于3000mg/dL时,AU上的配方改良试剂的观测结果显然在AMR内,这会潜在导致肾源蛋白尿显示为非肾源。值得注意的是,对于没有标记高白蛋白样品策略的试验,如此处研究的AU试剂,超过AMR范围可能会实际隐藏感染过量抗原的样品检测。例如,一份具有高尿白蛋白,发生钩状效应,浓度为35mg/L的样品使用AU试剂时会触发机载稀释,但是使用配方改良的AU试剂则会错误地报告为35mg/dL。无论如何,我们通过AU观测到的能导致这些假阴性结果的uALB浓度在容易受到钩状效应影响时,高于制造商标称的值。Siemens的BN II和Vista设备在任何检查的uALB浓度不会受钩状效应影响。Roche Cobas的“前带检查”功能确保标记出受过量抗原影响的标本,能够在稀释时避免报告假性偏低uALB浓度。DCA Vantage在标本的白蛋白浓度介于500-1000mg/dL时生成的结果位于AMR内,在所有被检测的试验中,这个试验是生理uALB浓度最容易受钩状效应影响的试验。蛋白尿是最早用于CKD的标志物之一,尿白蛋白排泄的变化能表明疾病进展或疗法效果。一些分析因素如试验间变异性和钩状效应能干扰可靠的尿白蛋白测量,这二者都是尿白蛋白测量不容忽视的。


在《临检》专刊中,《尿液显微镜检查的历史》一文回顾了尿液检查的历史。指出尿液的肉眼外观自石器时代以来就被萨满教巫医和医治者所研究,而对所谓的尿检的详尽解释作为一种预测形式开始于公元600年。千年以后,最早的原始单目显微镜和复式显微镜在荷兰出现,随着启蒙运动的发展,从1680年起尿液连同很多其它物体和液体被研究。但是,粗糙的早期仪器由于色彩和线形/球形模糊无法进行精细研究。在避免了这些问题的复杂多重玻璃透镜于1820年代被发明并由Lister在伦敦及Chevalier和Amici在巴黎使用以后,尿液显微镜检查在1830年代才成为实用的临床应用工具。1830年代后期Rayer及其学生(尤其是Vigla)在巴黎倡导在临床上应用尿液显微镜检查,1840年代该检查被传播到英国和德国,Nasse、Henle、Robinson和Golding Bird对尿沉渣的细胞和有形成分做了详细的描述和解释。开设了相关课程,最著名的是Donné在巴黎开设的课程。又过了50年,光学显微镜达到了鼎盛时期,使用浸液技术,放大率在1000倍以上,无色差。尿沉渣的图册在所有主要的欧洲国家和美国出版。1900年以后偏振光和相衬也被用于研究尿液,到20世纪初,显微摄影术(50年前Donné和Daguerre倡导使用,但是后来被忽略)普遍用于教学和记录。1940年代电子显微镜开始被使用,然后是用免疫荧光抗体检测特种蛋白和细胞。所有这些检查都是使用手持型方法。大约在1980年,机械辅助的观察方法出现,并从此占据主导地位。《临床化学和检验医学杂志》曾于2014年12月4日和5日在罗马举行国际讨论会,来自7个国家的11名发言人在讨论会上发言,来自8个欧洲国家的170多名临床病理学家围绕尿沉渣显微镜观察这一开放问题进行了讨论,讨论包括三部分。第一部分是关于一些关键尿沉渣颗粒,如管型、脂肪和结晶的现代观点。该领域的专家对这些颗粒如何进入尿液,何时正确鉴别这些颗粒以及如何结合其他尿液、检验和临床发现,在更加广泛的疾病如遗传异常脂质法布里病、结晶2-8二烃腺嘌呤缺陷等疾病中发挥重要诊断作用进行了叙述。第二部分是尿沉渣室间质量评价项目(EQA),尿分析国际指南是改进日常工作的关键工具。这一部分由在北欧、美国和意大利执行EQA项目的国际专家主持。第三也是最后一部分是关于目前尿沉渣分析自动化的进步。目前,自动化分析仪在大型临床实验室中占有一席之地。尽管临床病理学家和临床医师长久以来忽视这一项目,但是尿沉渣仍是肾脏和尿路疾病有价值和不可替代的诊断工具。本期刊登的《管型尿》一文首先叙述了影响管型生成和鉴别的分析前和分析因素,指出尿沉渣的形态学分析是尿液分析的重要组成部分,它是诊断肾脏和尿路疾病的关键工具。尽管许多国际和国内指南为实验室工作人员使用适当和标准的形态学取得最可靠的结果提供了良好支持,但是一些与标本采集、运输和储存相关的问题对尿液分析的质量形成严重的挑战。尿沉渣微粒的正确鉴别和分类包括需要高质量的管型标本如第二天早晨的空腹样品。这类标本能更好地保存微管的完整性,减少了因夜晚休息期间尿液在膀胱内留存时间过长导致尿液发生细胞溶解和变性。中段尿的采集是另一个重要的分析前因素,它能确保样品免受粘液或其他来自尿道以及尿路和生殖器外部区域的污染。通知患者进行体育活动,例如采尿前慢跑十分重要,这能导致包括血尿症和重度管型尿在内的尿液变化。在分析阶段,过度检查碱性尿是不明智的,高pH值阻止了管型的形成,且容易引起细胞成分的溶解。不利于管型正确鉴别和分类的其他条件包括:生殖器分泌物造成的样品污染,出现大量无定形磷酸盐和结晶,以及出现尿比重低或低渗透压摩尔浓度的尿液。应该重视样品的运输和储存。的尿液样品储存大于3小时可能导致管型和其他细胞成分的细胞溶解和变性。尿沉渣检查分析阶段的质量是生成可靠数据的关键,应该使用适合的技术和设备。近年来,实验室工作人员已经可以使用一些分析平台来进行分析。这些分析平台包括基于流式细胞术、数字图像捕获系统或者自动化智能显微镜的自动尿沉渣分析仪,但是低倍和高倍人工显微镜检查仍是这种试验的黄金标准。根据国际指南,使用相衬图像显微镜和偏振光仍是鉴别管型及其形态学细节的最佳方法。对于管型的形成,本文指出管型是圆柱形微粒,末端通常为圆形,源于Henle环边缘的上升、远端小管和肾脏管道的聚集,有一种特殊的模型即THG或尿调节素构成。它由Henle髓袢升支粗段的肾小管细胞分泌,具有纤维结构,纤维无支链,直径9-15nm。有趣的是,THG是所谓的生理学蛋白尿的最重要的成分,即使它的作用仍未完全明确(已经鉴别出一定的潜在作用,包括预防尿液感染和尿结石病)。在某种情况下,THG纤维聚集,形成柱状结构,具有外形类似管状内腔的柱状结构。一些因素如小管内超滤蛋白浓度升高、小管内pH值低以及高摩尔渗透压浓度容易造成纤维聚集,这解释了稀释的和碱性的尿液内管型的较为罕见或数量低的原因。本文还特别论述了颗粒管型、蜡样管型、包含肾小管细胞的管型及其临床意义。如透明管型,这类管型仅由THG构成,这就是它们具有低折射指数的原因。因此,使用明场显微镜进行显微镜检查这类管型是一项挑战,使用相衬图像显微镜检测反而更加有效,这种管型是一种“蓬松”、紧凑、旋绕或有褶皱的管型。


正常受试者体内也能发现透明管型,在平行生理学条件下,如剧烈运动之后,非肾病,如发热、脱水、急性充血性心力衰竭或与Henle髓袢利尿剂的使用有关。但是,所有的肾病情况包括血管球性肾炎的情况下透明管型会以多种数量出现,被研究的患者100%会出现透明管型,急性间质性肾炎患者86%的病例会出现透明管型。最重要的是,同时在正常受试者中和其他上述非肾病情况下,透明管型仅在尿道中发现,肾病情况下的透明管型总是与其他类型的管型和尿沉渣微粒有关。关于颗粒管型,这一类管型具有颗粒构成的表面,大小不一。颗粒相当多样,从细微(细微颗粒管型)到粗糙(粗糙颗粒管型)再有黑色、透明和有颜色的管型不一而足。已经证明患有蛋白尿的患者,细微颗粒包括可以被肾小管再吸收的超滤蛋白,同时非蛋白尿患者的粗糙颗粒很有可能来自于细胞成分的变性,如管型形成期间管状内腔里出现的白细胞和肾脏上皮细胞。颗粒管型的出现通常反映肾脏损伤,最近对急性肾损伤患者的研究表明这些管型和肾小管上皮细胞(RTEC)以及包含RTEC的管型一起出现,是急性肾小管坏死灵敏的标志物。关于蜡样管型,这一类管型的典型特征是和融化的蜡相类似(蜡样)的外观,这让它们具有高折射指数。它们通常为黑色,具有较钝的末端,锯齿状、破裂的边缘,尺寸较大,大小通常是其他管型的数倍。有趣的是,它们的构成仍然难以理解。最近一项关于蜡样管型的前瞻性研究显示,患有血管球性肾炎的患者中,THG并不是蜡样管型的成分,但是需要其他研究进行进一步确认。而且蜡样管型的临床关联不明,因为Atlases和教科书(例如肾功能进行或慢性肾脏淀粉样变性等)的报告没有发现任何支持性文献。目前,仅有的蜡样管型研究就是前文提到的前瞻性研究,通过相衬图像显微镜,以标准化方法评估了患有不同类型血管球性肾炎的287名患者的尿沉渣。仅在29名(13.6%)的患者体内发现了蜡样管型,出现频率远低于所有其他类型的管型。急性感染后血管球性肾炎和肾脏淀粉样变性中,蜡样管型具有较高的统计频率(每种条件44.5%),同时先天膜性肾病中蜡样管型的频率也较低(6.0%),病灶和肾小球硬化症则未发现蜡样管型。具有蜡样管型的患者用其他不具有蜡样管型的患者相比,血清肌酐水平显著较高(159vs.97μmol/L,p<0.0001),出现蜡样管型显著与颗粒管型和白血球管型相关,但与透明管型没有关联性。关于脂肪管型,这类管型可能包含脂肪滴、椭圆形脂肪体或胆固醇结晶,而且通常与这些成分的游离形式有关。脂肪管型的鉴别可能需要使用偏振光显微镜,在这种显微镜下,嵌入到这种关系模型中的脂肪微粒看起来就像“马耳他十字”。尿液中出现脂肪管型与重度蛋白尿有关,肾病综合征患者体内曾发现过脂肪管型。对于细胞管型,这类管型包括所有内部包含可能出现在肾小管内细胞类型的圆柱,如白细胞、红细胞和RTEC。因此,细胞管型可以分为白细胞管型、红细胞管型和RTEC管型。白细胞管型包括不同数量的白细胞,它由于在尿液内具有特殊的物理-化学特点,难以同RTEC区分。此时,使用相衬图像显微镜可有助于正确鉴别该微粒。尿路感染患者出现白细胞管型意味着包含肾脏薄壁组织,从这个临床立足点出发非常重要。通常急性间质性肾炎患者会出现白细胞管型,但是很少有人了解肾小球疾病的患者也会出现白细胞管型。红细胞管型包含不同数量的红细胞。有时红细胞的数量很大,此时该模型的无法区分。红细胞管型可以作为肾小球血尿的标志物,尤其是当它们与尿液中游离的同质异形红细胞有关时。尽管红细胞管型的频率在许多研究中多种多样,但是大部分的肾小球疾病中会发现红细胞管型,尤其是患有肾小球细胞增生时(所谓的增生血管球性肾炎)。但是,和现有观点相悖,红细胞管型也会出现在患有急性间质性肾炎(AIN)的患者体内,正如最近的一项回顾性研究所示:该研究涉及21名因不同原因患有AIN的患者,其中6名患者(28.5%)出现红细胞管型尿。假设在这样的病例中,红细胞表型的形成是间质血管损伤的结果,其次是间质细胞炎症的结果,红细胞溢出到胞间隙,充斥管状内腔的后续通道通过管状基膜突破,这在AIN中很常见。肾小管上皮细胞管型(上皮管型)可能包括多种肾小管细胞,通常伴随游离肾脏上皮细胞,这最终有助于该管型的鉴别。在进行准确鉴别时可能会出现一些挑战,尤其是当细胞变性且难以同其他白细胞区分时。这时,建议使用相衬图像显微镜或粒子活体染色。一些肾病包括血管球性肾炎和急性间质性肾炎可以发现上皮管型。几年前发表的一项初步研究证明:基于急性肾损伤患者体内RTEC管型和颗粒管型的综合数量的管型评分指数(CSI)与肾脏预后有关,肾功能未恢复患者的CSI显著较高。而对于包含结晶或微生物的管型,事实上几乎所有管型内都会发现某种类型的结晶,这些结晶由草酸钙构成,草酸钙一水合物或二水合物最为常见。这类管型明确表明结晶沉淀在管状内腔中,这一发现有助于急性肾损伤如急性尿酸盐肾病结晶形成的诊断。肾脏组织感染可能引起包含微生物的管型出现。微生物管型难以鉴别,使用相衬图像显微镜可以将微生物管型同其他管型区分开来。本文最后总结,管型是肾脏疾病诊断相当有效的标志物。根据起源、成分、形态学和临床关联性已经对它们中的许多进行了明确的定义,但是其中一些(如蜡样管型)的可用信息较少。最近的研究已经有了一些有趣的发现,尤其是在鉴别与急性肾小管坏死相关的肾损伤患者时,RTEC管型非常有价值,同时AIN患者出现红细胞管型以及血管球性肾炎患者出现蜡样管型在诊断上也非常有价值。在过去的10年中,使用不同技术如明场自动化显微镜、流式细胞术和数字影像捕获系统的自动化分析仪的商业化大大促进了尿液微粒成分科学研究的发展。尿液分析标准化、提升分析准确度和效率方面,应该大力推广使用这些工具。但是这些仪器管型鉴别的总体准确度还需要进一步提高,最佳的管型鉴别目前仍要依靠传统的显微镜形态学分析。由于管型的鉴定是及时而准确地诊断肾病的关键,实验室工作人员应该接受培训,以便在尿沉渣分析中能准确鉴别和分类管型。在使用标准方法如明场、相衬图像或偏振光显微镜以及特殊细胞学染色进行管型鉴别和分类时,实验室工作人员应该接受特殊培训。因此,在尿液分析的分析前和分析阶段,临床实验室参与可靠的室内质量控制计划(IQC)和室间质量评估(EQA)计划是至关重要的。实验室应该联系国际或国内协会或工作组如欧盟检验医学协会(EFLM)或意大利尿液分析工作组(GUAU)。这些组织的成员进行尿液分析的科研升级、多中心研究、召开大会和会议或其他教学性活动。我们的最终目标是以患者的临床需求为出发点,秉承现代个体化医疗理念,提高尿液微粒临床形态学分析能力提供更新的、更有效的和更直观的实验室报告。本期刊登的《晶体尿》一文指出,晶体尿研究有助于:诊断致结石的遗传性疾病(例如,原发性高草酸尿症、胱氨酸尿、腺嘌呤磷酸核糖转移酶缺乏症);鉴别药物引起的结晶—可导致急性肾损伤以及慢性肾病;评估与结石形成有关的代谢障碍;评估结石患者的复发风险。由于代谢原因引起的结晶是因为两组物质即结晶化的促进因子与抑制因子之间的平衡被打破。促进因子是由肾脏分泌的物质,其浓度超过了尿液使它们保持可溶性分子和离子的能力。钙、草酸盐、尿酸盐和磷酸盐离子是主要的结晶促进因子。抑制因子,通过肾小球滤过抑或局部由肾小管细胞产生,是能够避免或延缓结晶形成、生长、聚集和/或粘附于肾小管上皮细胞的物质。在抑制因子中,较小的离子和分子比如镁、柠檬酸盐和焦磷酸盐,与某些促进因子形成复合物,这种情况减少了尿液过度饱和。大分子比如骨桥蛋白、bikunin(双库尼茨抑制剂)、基质GLA蛋白、Tamm-Horsfall蛋白或尿凝血酶原片段1,也能够阻止晶体生长、聚集和/或粘附于肾小管细胞,因而通过尿流使晶体从肾脏中排除。关于晶体尿的研究方案,本文提出晶体尿研究必须按照适当的方法进行。研究条件应该包括受试者平常的生活习惯和营养状况,空腹条件,首次晨尿的全部尿量(由于夜间摄水量减少,通常最佳);即使这样,还应该考虑空腹条件下的第二次晨尿。盛放全部尿量的容器应该在排尿后2小时内送到实验室,室温保存并立即处理。必须优先使用相衬显微镜检查晶体,该显微镜还必须配备偏振光设备,能够显示晶体的双折射特性,也是正确识别必须的,尤其是当晶体的形态学不常见时。如今,自动化尿沉渣检查仪器,不仅能够提供质量良好的图片,还可用于鉴别最常见的晶体。在检查晶体尿样本时尿pH是一个重要的特征。对此,必须记住大多数结晶种类都对pH敏感,只有草酸钙和2,8-二烃腺嘌呤晶体例外,对于它们来说有利于沉淀的主要因素是过高的摩尔浓度。相比之下,高pH依赖性的种类可在特定pH范围内形成晶体,甚至是在正常或相对较低的摩尔浓度下。pH依赖性溶质的最佳例子是尿酸:在尿pH为5.0时,尿酸在约2mmol/L的摩尔浓度下会结晶,而在pH为5.9-6.0时,尿酸结晶则需要≥4mmol/L的浓度。因而,晶体尿研究必须准确测量尿液pH。轻轻摇匀样本后,显微镜检查包括尿细胞学和晶体的综合评估,也就是晶体的特性、数量及其聚集体大小的测量。然而,每种结晶较宽泛的形态谱,加上其复杂的化学组成,使晶体鉴别变得困难,查阅关于此主题的文章和尿沉渣图集对该任务有帮助。通过形态学以及偏振特征和尿pH无法鉴别的晶体,尤其是怀疑由遗传性疾病或药物引起时,推荐使用红外光谱法。文章还介绍了尿晶体的主要分类,以及晶体尿评估对于诊断和随访结石复发患者的用处。本期刊登的《自动化尿液筛查设备使诊断实验室的尿沉渣显微镜检查变得经济可行》一文认为,相对于人工显微镜检查,自动化尿液分析设备具有可再现、准确且速度更快的特点。使用这些设备执行的分析已经能缩短周转时间并减少人力成本,这使得这些设备相对于人工显微镜检查更加经济有效。


在《POCT》专刊中,辛忠涛的《量子点及其在生物医学特别是体外诊断领域的应用》一文首先介绍了量子点材料的概念。量子点(quantum dots,QDs), 又称半导体纳米晶,是准零维的纳米材料。量子点是三个维度的尺寸小于或者接近于波尔半径(一般直径不超过10nm),粒子由少量的原子所构成。按照其元素组成,量子点可以分为II-VI族量子点(如CdTe、CdSe等)、IV-VI族量子点(如PbSe等)及III-V族量子点(如InP、GaN等)等。其中II-VI族量子点具有合成方法简便、光学性质优异等特点,因而更受到研究者的关注。近年来,合金量子点也受到广泛关注,如CdSeTe、CdZnSe、CdTeHg等,通过掺杂新的元素来调节量子点的发光特性和发光范围,提高量子产率。量子点是由于电子和空穴被量子限域,连续的能带结构变成具有分子特性的分立能级结构,受激发后发射荧光。量子点所具有的独特性质是基于它自身的量子效应,当颗粒尺寸进入纳米量级时,尺寸限域将引起尺寸效应、量子表面效应、小尺寸效应、介电限域效应及宏观量子隧道效应,从而展现出许多不同于宏观材料的光学性质。正是由于量子点的独特特性,在生物医学光电领域有特殊的应用价值。正因为如此,2003年,《Science》将量子点列为当年度的十大科技突破之一,2006年《Nature》将量子点评为最有可能实现大规模应用的四类纳米材料之一。在介绍了量子点特点和合成方法之后,文章着重介绍了其在体外诊断上的应用。如荧光共振能量转移,荧光共振能量转移(FRET)是一种非辐射能量跃迁,当供体吸收一定频率的光子后被激发到更高能级的电子能态上,在电子回到基态前,通过供体-受体偶极之间相互作用,实现了能量向邻近的受体分子的转移,同时供体荧光分子自身的荧光强度下降。 相比传统的荧光染料分子,量子点在荧光共振能量转移方面具有很多独一无二的优势:量子点吸收光谱宽、量子产率高、荧光寿命(10-50ns)比有机荧光染料荧光寿命长(1-5ns);量子点可以发射可见光区任意波长的光,这样就保证了供体发射波长与受体吸收波长良好的重叠,提高了荧光共振量转移的效率。也正因为量子点的上述特性,量子点作为能量供体在FRET中的应用有很多,而作为能量受体的应用却很少,这是因为选择有机荧光染料作为FRET能量供体时,会使得量子点与能量供体同时被激发。选择量子点作为能量供体,同时在量子点表面修饰上各种分子用以识别被检测物,最后通过和被检测物之间的特异性反应,达到荧光共振能量转移发生或中断的目的。这种分析手段可以分为三种方法:第一种是通过量子点供体表面的小分子和荧光分子受体表面的检测物之间的特异性识别,将荧光分子固定在量子点周围,发生荧光能量共振转移,导致量子点荧光淬灭;第二种是将受体荧光分子先固定在量子点供体表面,而加入检测物后,通过被检测物和量子点表面分子的相互作用,取代受体荧光分子,使荧光分子受体从量子点表面脱离,荧光共振能量转移被打断,导致量子点荧光增强。第三种是将受体荧光分子先固定在量子点供体表面,加入检测物后,改变量子点供体和荧光分子受体之间的相互距离,增强或者减弱荧光共振能量转移的效率,导致量子点荧光强度变化。目前随着研究的不断深入,一些长荧光寿命的镧系荧光分子开始作为给体,而量子点作为受体也应用在荧光共振能量转移体系中,此外基于量子点和量子点之间的荧光共振能量转移也逐渐被应用在各种分析检测实验中。同时,更多更有效的受体也逐渐被发现,例如石墨烯、碳纳米管、金纳米球、金纳米棒等具有大比表面积的纳米材料作为受体和量子点共同应用在荧光共振能量转移体系中,由于纳米材料具有大的比表面积和高的表面活性,两种纳米材料的引入可以大大提高检测的灵敏度和检测速度。虽然基于FRET机理的量子点得到如此广泛的应用,但还是存在自身局限性的。这种局限在于:由于量子点在溶液中以胶体状态存在,量子点的尺寸实际上是比染料分子大的,因此染料作为受体并不能离量子点距离很近,也就是说,即使能量给体与受体距离再小,也是会稍大于量子点的半径的。因此,这会限制组装长波长(发红光的染料)与量子点之间的组装。在生化检测方面,量子点表面有着大量的稳定剂,这些稳定剂不仅通过静电排斥作用保证量子点的稳定性,同时也赋予量子点特异性识别目标分子的特性,并引起量子点响应信号的变化。因此引入的分析对象若能与量子点发生一定的物理、化学作用,从而改变量子点表面的电荷或结构组成,甚至引起量子点的电子-空穴重组,那么就会导致量子点荧光强度的增强或猝灭。当量子点的表面缺陷通过化学反应和其他分子发生作用后,量子点的表面被钝化,量子点荧光增强,同样,当某些分子通过化学作用将量子点表面的稳定剂剥离,量子点表面产生更多的缺陷,被活化的量子点荧光被淬灭。通过这样的反应机理,量子点经常被用在检测一些氧化性强的小分子,如过氧化氢,并通过一些会产生过氧化氢的反应,来检测各种有机分子、酶或者酶的抑制剂,例如农药等物质。此外,利用金属量子点常常直接作为金属离子传感器来检测溶液中的金属离子,例如Cu2+、Ag+、Zn2+和Hg2+等,由于这些离子和Se2+离子的作用要强于Cd2+离子,因此这些金属离子会取代量子点表面的Cd2+,导致量子点荧光的淬灭。为了提高检测的灵敏度和选择性,许多课题组通过在量子点表面修饰上其他功能化分子构建金属传感器,如多肽、BSA和硫酸基分子等,通过这些基团和金属离子的特异性作用,导致量子点的荧光淬灭。迄今科学家们已经开发出了多种量子点传感器,检测的指标已经突破了单纯的重金属离子,可以检测的指标包括大多数血气分析项目、酶、蛋白质及葡萄糖等。但是必须承认的是,依赖量子点所建立起的各种传感器由于测试的对象不同,原理和种类各异,没有统一的标准,通用性较差,未来可能需要在某个局部获得突破而率先应用到临床上,在此之前,我们还要做许多探索性的工作。在细胞标记方面,1998年,Alivisatos 和Nie课题组第一次使用量子点探针成功实现了对固定的单层细胞标记以来,许多不同的细胞抗原和组织抗原,在固定后使用量子点探针均可以进行相应的标记,甚至可以标记特质膜蛋白、胞浆蛋白及核蛋白等,并可直接用于高分辨透射电镜观察。研究已经证实,对于固定后的细胞标记,量子点较传统荧光染料更具有优势。最近,多光谱的、可定量的量子点标记技术已经在固定和包埋后的多种组织中实现标记,包括前列腺癌组织、乳腺癌组织及冠状动脉和大动脉等。最新的进展包括使用免疫组织化学进行蛋白质的检测,以及使用量子点技术进行荧光原位杂交以检测相应的核酸均已实现。将量子点基础的荧光探针技术引入病理学及分子生物学领域,必将为这些领域带来革命性的改变。在荧光免疫吸附试验(QLISA)方面,基本过程类与传统的酶联免疫吸附试验基本相同,只是用量子点标记物(抗原或抗体)取代了酶标记物,因此不需要底物,反应完成后,经过洗涤纯化后,可以用荧光光度计直接来检测酶标板微孔中量子点荧光强度。由于量子点的荧光强度与待测溶液中抗原的含量成正比,因此可以采用一系列标准浓度作为参照,从而实现可定量检测待测抗原的目的。例如Goldman等人将水溶性的表面带负电荷的CdSe/ZnS核壳量子点与带正电荷的生物素分子偶联,利用生物素和亲和素特异性的相互作用,建立起了一种高灵敏度的量子点免疫分析检测平台,成功的用于葡萄球菌肠毒素B和霍乱毒素的分析 [Goldman ER 2002]。之后,该课题组又将不同的抗体偶联到不同发光波长的量子点表面,在单个微孔板里实现了对霍乱毒素、蓖麻毒素、类志贺菌毒素I和葡萄球菌肠毒素I的同时检测 [Goldman ER 2004]。尽管这种方法不需要酶底物,操作相对简单,而且可以在一个微孔板内实现多重检测,但操作过程仍有洗涤等操作,而且其检测灵敏度并没有较酶联免疫吸附方法有显著性提高,特别是需要专有的荧光光度计来检测,而这种设备往往不及酶联免疫吸附仪在医疗系统中保有量高,因此基于QLISA的免疫检测,在临床上的应用前景受到很大程度的限制。在均相时间分辨荧光方面,均相时间分辨荧光(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence,HTRF)概念是由镧系元素建立起来的,是一种用来检测纯液相中待测物的技术。该技术结合了荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)和时间分辨荧光(Time-Resolved Fluorescence,TRF)两大技术。时间分辨荧光TRF其基本原理是利用稀土元素镧系元素的独特性质,其荧光比普通荧光持续时间更长。普通荧光的半衰期为纳秒级,镧系元素的半衰期为毫秒级,有6个数量级的差别。所以在检测时,TRF有一个时间延迟~50微秒,从而使普通荧光信号几乎为零,因此背景非常低,反映样品实际情况。与非均相的试验如ELISA以及基于量子点的QLISA相比,均相免疫分析是反应达到平衡时,无需对反应平衡后结合的和游离的标记物进行分离,便可以直接进行后续检测,省却了洗涤的步骤,可减少操作带来的误差。由于均相免疫分析不需要包埋、冲洗等多个步骤,通常具有灵敏度高、背景荧光值低、信噪比高、应用范围广、性质稳定、便于操作、易于微型化和自动化等化点。Hildebrandt等用具有长寿命激发态荧光的稀土元素的螯合物Tb标记链霉亲合素,与生物素修饰的量子点发生特异性结合,在308nm激发下,Tb的螯合物作为能量供体与作为受体的量子点产生了显著的FRET现象,采用时间分辨模式(时间窗为激发脉冲后的250-1000μs)后,有效避免了本底荧光和自身荧光的干扰,在均相体系中检测灵敏度高达10-12M,这是首次进行均相时间分辨分析的尝试 [Hildebrandt N 2005]。国内南方医科大学的刘天才课题组在量子点均相免疫荧光方面进行过有效探索,以修饰后的Tb螯合物作为能量供体,以量子点作为能量受体,检测了AFP和CEA,灵敏度均可达到0.4ng/ml [Chen MJ 2012;Chen ZH 2013]。但量子点毕竟作为一种新生荧光材料,因此其在均相时间分辨中的应用报道较少,未来还有待大量的研究去探索和证实。在免疫层析方面,随着检验检测需求的不断发展,早期使用的胶体金作为标记物的侧向流免疫层析检测方法越来越暴露出其种种不足,难以满足高灵敏度、定量检测等要求,也容易存在人为判断误差,造成漏检等现象。近些年,随着材料科学的发展,尤其是新型纳米材料的制备及应用研究的快速发展,逐渐涌现出一系列新型标记物,如胶体碳、稀土元素时间分辨微球、上转发光、荧光微球、磁珠以及乳胶颗粒等,适用于不同检测要求:提高了检测灵敏度、适用于定量检测或适用于多重检测。正因为这些技术的发展,改进和完善了传统的免疫层析检测技术,为免疫层析技术的更广泛应用奠定了基础。但是上述的这些材料在兼顾多重检测方面仍存在很大的不足,而量子点材料由于独特的性能在免疫层析上显示出其独特的优势,特别是在多重检测方面,因此很快吸引了相关学者在这方面的探索。关于量子点在免疫层析试纸上的应用,早在2000年左右就有报道,但相关技术细节较少,也无后续产品推出。2003年Lingerfelt等报道了制备量子点-生物素复合物的方法,并将其应用到免疫层析柱分析上,使用免疫层析柱的方法可以最低检测到10ng/ml的B型葡萄球菌肠毒素[Lingerfelt BM 2003]。2009年,国内张国华等人通过制备的量子点标记莱克多巴胺抗体、组装试纸条、验证试纸条等一系列步骤,证实了量子点免疫层析试纸条在10min内可实现莱克多巴胺残留的快速检测,检测限为3ng/ml。该方法在保证量子点自身性质(如:生物兼容性好、荧光寿命长等)的同时,也证实了该试纸条测定的实验结果稳定性好。随后掀起了量子点进行免疫层析多重检测的热潮。但纵观已经出现的报道,多是集中在食品安全检测领域,包括大分子的毒素和细菌,也包括小分子的化合物甚至农药和抗生素。同胶体金一样,检测大分子采用基于三明治夹心法,如有学者采用量子点荧光免疫层析试纸条检测食源性病原体空肠弯曲菌(C.jejuni)和大肠杆菌O157:H7,灵敏度均在104CFU/mL以上,远远高于胶体金的灵敏度,且准确性与传统方法一致 [Xu F 2013]。检测小分子采用竞争法,如Zou等基于竞争法建立了检测3,5,6-三氯吡醇(TCP)的荧光量子点免疫层析技术,此方法可对血浆中有机磷农药的残留量进行快速检测,最低可检测到1.0ng/mL TCP标准品,回收率达102%,并且大大降低了检测结果出现假阳性的可能[Zou Z 2010]。随着量子点在食品安全免疫层析上的应用,学者们开始将其应用到临床检测中,并进行了大量临床标志物的探索性检测工作,积累了大量的科学数据。2015年深圳市金准生物医学工程有限公司开发的基于量子点平台的PCT免疫层析检测试剂,正式获得CFDA认证,标志着基于量子点免疫层析POCT试剂正式登上了临床诊断的舞台。随后,泰州海王纳米生物医学科技有限公司开发的CRP和hsCRP也相继获得CFDA的注册认证。量子点所具有的特性使其在免疫层析上具有独有的技术优势,量子点虽然荧光强度较高,这会显著提升其检测灵敏度,但仍需要将量子点包裹成微球,才能将灵敏度提高另一个数量级以上的水平。量子点荧光微球不仅具备了量子点本身的各种光学特性,它优于裸量子点的方面更表现在:第一,它在微球壳结构的保护下具有更为稳定的物化性质及光学性质,受外界条件(溶剂、电、热、磁等)影响小。量子点在条件较苛刻的环境(如极酸或疏水性较大的溶液)中容易发生外层高聚物的脱落而引起不可逆聚沉或荧光淬灭,而微球不存在这一现象;第二,一个量子点微球内部通常包裹了几十甚至上百个量子点颗粒,其发光强度比单个量子点更大,有利于提高检测灵敏度;第三,量子点微球的纯化也比量子点更方便。常规量子点在标记过程中只能采用超高速离心或超滤方法回收标记产物,而微球粒径在几十纳米至几百纳米不等,在10000rpm的离心速度就能使微球在常用反应液中沉降,操作极为方便。同时,我们也应该看到量子点免疫层析所面临的一些问题:1.量子点的材料制备技术要求较高,国内大多量子点生产企业还在沿用小作坊式的生产方式,导致生产出的量子点稳定性难以满足IVD对于诊断原料的稳定性要求,导致企业生产出的诊断试剂批间稳定性受到影响;2. 量子点的标记技术要求较高,建立稳定可靠的抗体标记方法,是生产高质量诊断试剂的必要前提;3. 尽管量子点的荧光强度和光稳定性较强,但仍需要配合高亲和力高质量的抗体原料,才能生产出高性能的诊断试剂;4. 量子点较以往有机荧光染料最大的优势在于其能形成多重检测,但在免疫层析现有应用上,还没有将量子点多重检测的优势完全发挥出来。究其原因,可能与仪器研发的落后有一定的关系,现有的仪器因为成本控制因素,多采用常规免疫荧光的仪器设备检测量子点,这些设备在滤光片的设置上只考虑一种荧光,而缺少真正的用于量子点检测的设备,未来期望能够推出装备多种滤光片检测设备,这样就可以在一条检测线上通过抗体和量子点的配伍来检测不同的指标,真正实现量子点的多重化检测。在微流控检测方面,微流控在量子点上的应用涵盖了微流控量子点合成及微流控量子点在诊断上的应用 [Vannoy CH 2011],重点介绍其在诊断上的应用。Hu M等人采用量子点微流控检测CEA和AFP,并通过5%BSA封闭非特异位点以及采用含吐温的洗液来降低背景,这种方法可以使肿瘤标志物在缓冲液中的检测LOD达到250fmol/L,CEA在血清里的检测灵敏度达到2.5pmol/L,远远高于常规方法的检测灵敏度 [Hu M 2010]。量子点多色微球在微流控中最初是由Riegger最早报道的,他们采用两种不同的量子点包被聚苯乙烯微球,并在不同的微球上包被两种不同的抗原,即甲型肝炎病毒和破伤风毒素,用来捕获检测标本中的相应抗体。结果发现仅仅孵育3分钟,洗涤时间20s,对甲型肝炎病毒和破伤风毒素检测的灵敏度就可以达到215mIU/ml和158mIU/ml,这个研究确认了量子点多色微球在微流控研究中应用前景。Klostranec等人采用2色2密度的量子点荧光微球,并采用微流控的方法进行检测血液中最常见的三种病原微生物HBV、HCV和HIV,使用的样本量不超过100μl,反应时间在一小时内,反应灵敏度比现有FDA批准的产品灵敏度高50倍以上 [Klostranec JM 2007]。本文最后总结道,量子点材料在过去10年因为技术上的突破,已经应用到生命科学的各个领域,特别是在体内动物造影上,越来越显现出其独特的技术优势,但是由于量子点自身的材料学特点所决定,目前量子点在体内应用(包括体内影像和药物治疗)还仅仅限于试验动物阶段,未来如果应用到临床人体上去,还需要面临并解决许多问题:1)量子点材料的安全性问题;2)量子点与体内的血液系统是否会发生凝集反应;3)量子点与体内的免疫系统是否会发生免疫排斥;4)量子点在体内的药代动力与研究,如相关的代谢途径、代谢周期、体内器官分布以及体内排泄主要途径、在体内的半衰期等等。以上这些问题均是量子点真正走向临床体内造影和药物治疗所要面临的问题,在此领域还要做大量的探索性研究工作。与体内诊断和治疗不同的是,体外诊断由于不涉及相关的安全性等问题,是量子点走向临床最快的领域。量子点在临床上应用最成熟的一个领域就是免疫层析,目前已经有CFDA注册认证的产品问世,而另一个潜在的巨大市场——病理诊断目前还未被探及,此外多色量子点微球在流式检测及微流控检测方面也显示出了其独特的技术优势,因此有理由相信,未来随着量子点技术的越来越成熟,会有越来越多基于量子点的创新型诊断试剂走向临床。本期的《sST2—前途无量的心衰管理标志物》一文指出,ST2是白介素1受体家族的成员,循环系统中可溶性ST2(soluble ST2,sST2)浓度可以反映心血管应激和纤维化的情况。近期研究表明:sST2在慢性和急性心衰预后管理方面,虽是新标志物,但潜力巨大。心衰检测金标准 NPs(natriuretic peptides,NPs)和sST2联合应用于心衰风险分级效果显著。sST2被视为自NPs以来,在心衰领域特别是在指导心衰治疗方面出现的最有前景的标志物。一般认为BNP(B-type natriuretic peptide,BNP)和NT-proBNP(N-terminal-proBNP,NT-proBNP)是急性心衰诊断的金标准指标。但是NPs在心衰预后管理方面的作用并不突出,对心衰的临床治疗指导意义不明确。ST2作为一个非常有前景的心肌纤维化和心肌重塑的标志物,已成功应用到传统心衰病人管理中。本文介绍了ST2生物学特征及在心衰领域的临床价值。本期刊登的《ST2和半乳糖凝集素3:准备迎接黄金时代》一文指出ST2和半乳糖凝集素3是心衰领域已经被广泛研究的新型生物标志物,它们不仅能预测HF患者的住院和死亡情况,与利钠肽相比还能提供额外的预后价值。本文的目的是对慢性、急性和心衰事件的相关生物标志物进行综合评估。无论是哪种心衰类型,这2种标志物似乎都能在临床模型包括利钠肽(NP)外产生额外影响。结合多种生物标志物的策略最终证明有利于未来的HF治疗指导。但是,额外的预后价值似乎有限,需要前瞻性试验检验其与观测结果的一致性,最终在心衰算法中纳入ST2和半乳糖凝集素3。本期刊登的的《检验分析中对可溶性ST2和半乳糖凝集素3的认识》一文指出,蛋白质可溶性ST2(sST2)和半乳糖凝集素3作为心脏疾病的备选生物标志物越来越引起人们的兴趣。越来越多的证据表明这2种分析物的血浆浓度能独立作为生物标志物或附加于其他现有标志物如心肌肌钙蛋白或钠尿肽提供心脏疾病患者的预后信息。2013 AACF/AHA指南将sST2和半乳糖凝集素3都作为急性和慢性心衰患者附加的风险分层生物标志物。蛋白质sST2(也被称为类白介素1受体,B亚型),是一种长度为328氨基酸,分子量为36993Da的蛋白质,该蛋白质在一些位置被糖基化。蛋白质半乳糖凝集素3(也被称为Mac-2抗原或碳水化合物结合蛋白35)是一种长度为250个氨基酸,分子量为26152Da的蛋白质,可以形成二聚体或更高阶的低聚物。本文提供了关于循环sST2和半乳糖凝集素3测量的分析考虑的信息,包括这两种生物标志物的体外稳定性、生物学变化和参考范围。


在《肿瘤》专刊中刊登的《结直肠癌病因/治疗相关方面最新学术研究进展》一文指出,癌症干细胞(Cancer Stem Cell,CSC)假说认为,与正常组织相似,有一小部分特化的细胞保留了具有自我更新的能力并持续的发展为肿瘤。癌症干细胞在肿瘤的发生、进展、转移和复发等各个阶段都有涉及,使得它们成为了特别适合的治疗和干预靶标。尽管已有许多文献报道了由众多标记能够用来鉴定癌症干细胞,但这些标记却往往对肿瘤细胞缺乏特异性,因而也能够同样标记正常的组织干细胞。这些标记在癌症干细胞与正常干细胞之间的重叠就带来了这样的问题,即如何在不对正常组织进行破坏的条件下有效地对癌症干细胞进行有效的靶向治疗。除了对肿瘤的特异性缺乏了解,对众多癌症干细胞标记的生物学相关性信息也了解的并不多。因此目前尚不清楚是否这些肿瘤细胞的存活依赖于这样的标记抑或是这些标记的表达仅仅是随环境需要而产生的。来自于美国Genetech公司的研究人员在其论文中指出,通过化学方法连接于抗体的抗体药物复合物(Antibody drug conjugates,ADCs),以及细胞毒性药物则有可能可以解决这一难题。ADCs识别肿瘤细胞表面的抗体,与其结合、并将细胞毒性药物优选地递送至肿瘤细胞。有些用于ADC癌症治疗的靶向表面分子同时也在正常的组织细胞中有表达,具有临床有效性但却没有毒性。这样的ADC就可以用于靶向这几种肿瘤细胞了。因此,这样的ADC策略就可以应用于去除癌症干细胞而不影响正常干细胞的功能。一种研究的很清楚的干细胞类群是胃肠道中的LRG5隐秘细胞,其对所有稳态肠道上皮细胞中的所有分化细胞类型都有作用。LRG5+细胞可成为肠道癌症的原始细胞并扮演癌症干细胞的角色,说明去除LRG5+细胞可以对肿瘤生长和维持具有重要的意义。对来自于LRG5+细胞的腺瘤性结肠息肉病(APC)突变肿瘤的谱系追踪表明,在肠道肿瘤中的多种细胞类型都源自于LRG5+祖细胞。此外,LRG5+细胞还被认为与肿瘤的发生与持续性增长关系密切,提示消除LRG5+细胞可以肿瘤的生长和维持具有重要意义。对于将靶向LRG5+细胞作为治疗策略的一个最重要问题就是,LRG5+是否也在正常的肠道干细胞或者其他细胞上有标记,从而会影响其正常的细胞组织功能。因此,本研究的目的就在于开发出这样一种治疗策略,其能够允许在不影响正常组织的条件下来选择性靶向LRG5+肿瘤细胞。而本研究的数据也表明,经过适当设计的ADC可以有效地靶向癌症肿瘤细胞,尽管在正常干细胞上也有靶向表达。研究首先再次对正常组织和肿瘤组织进行了微阵列mRNA表达检测,与之前的报道类似,LGR5在正常的人大肠组织中的表达水平极低,而在直肠癌和卵巢癌中具有相当高的表达水平。为了制备抗体药物复合物(ADC),研究人员首先制备了用于ADC治疗基础结构的抗LGR5抗体。采用的方法是DNA免疫制备杂交瘤的方法,效果最好的是8E11克隆,其对于小鼠、大鼠和人LGR5的亲和力分别为0.4、2.4和0.2nM,该抗体并不会与LGR4或LGR6发送交叉反应,也并不会调制Wnt信号通路或阻断R-spondin结合。虽然采用标准方法对其进行人源化,获得了hu8E11v2抗体。为了验证LGR5是否适合作为ADC的靶点,将2种作用机理不同的可切除连接药物轭合于hu8E11v2上。第一个药物轭合物是经过临床验证的、含有微管抑制剂通过蛋白酶可降解连接物连接于抗体上链间二硫键的半胱氨酸的单甲基澳瑞他汀E(MMAE)。这一连接物药物技术可用于新近批准的抗CD30 ADC色瑞替尼,用于治疗复发性何奇金氏瘤。第二个连接物药物是NMS818,其含有连接于拓扑异构酶抑制剂蒽环类抗生素PNU159682的C-14羟基的乙酸成分。这两种ADC的活性代谢物具有不同的作用机理,抗有丝分裂(MMAE)和DNA损害(PNU159682)都能够有效地区别作用于正常和肿瘤组织。结果表明抗LGR5-NMS818有广谱范围的肿瘤细胞杀伤作用。在异源移植模型中,与剂量匹配的对照相比,抗LGR5-MC-vc-MMAE与抗LGR5-NMS818都表现出较高的效力,说明在高表达LGR5的条件下,这两种药物在体内都具有类似的效果,10mg/kg就能够使得肿瘤停止生长或缩小。在肠道肿瘤发生的遗传修饰小鼠模型中,研究人员制备了具有条件性突变KrasG12D的APCmin肠道肿瘤发生模型。在采用抗LGR5-vc-MMAE的治疗组中,肿瘤的增殖率大大降低,且在2周之后发现了LGR5+细胞亦大幅减少。在长期LGR5靶向效果实验中,与对照相比,抗LGR5-ADC治疗组的生存时间要更加延长。文章接着介绍了FDA批准的几种结直肠癌伴随诊断试验,如The cobas® KRAS突变试验、therascreen KRAS RGQ PCR试剂盒、DAKO EGFR PharmDx试剂盒等。文章最后总结道,尽管传统观点认为结直肠癌的发病岁数中位数基本在70岁,但目前在低于50岁年龄段的发病率缺有所上升。因此进行一般性的基因检测也对于常规筛查容易漏检的个体具有补充作用。同时,还对结肠癌患者进行切除术后接受亚叶酸、氟尿嘧啶和奥沙利铂联合或不联合西妥昔单抗的治疗,进行了对BRAF和KRAS突变与预后相关研究,结果表明BRAF V600E和KRAS突变显著与患有微卫星稳定型肿瘤患者较短的无病存活(DFS)以及总存活(OS)相关,与罹患MSI肿瘤患者较短的无病存活(DFS)以及总存活(OS)无关。随着技术手段的进步,对结直肠癌的诊断、治疗也在从单基因单药物向多基因多药物的方向进行转变,因此对结直肠癌的分子亚型进行分型,对实现精准治疗有重大的意义。目前美国癌症协会推荐在50岁之后的人群中,应该每年进行一次便潜血或粪便免疫学化验的筛查,而目前美国FDA批准的结直肠癌相关检测也有Epiprocolon和Cologuard两个不同的试剂盒。除了基因突变意外,肠道微生物菌群的组成,比例与结直肠癌的发病也有重要的关联,探讨肠道微生物菌群的数量以及组成的变化,对于深入了解肠道炎症以及癌症都有着极其重要的意义。期望我们提供的这些内容,能够为结直肠癌领域相关临床医生和研究人员提供一些观点和思路,从而能够更好的服务于患者的早期筛查、检测与治疗,提高患者生活质量。本期刊登的《结肠直肠癌的筛查实验》一文介绍说,Epi proColon是一种用于结肠直肠癌筛查的血液试验,但该试验尚未经过存在较高的CRC风险人群的确认。该试验检测血液样品中称为胞裂蛋白9(Septin9)的特殊类型的DNA。血液中存在胞裂蛋白9与结肠直肠癌高度相关。胞裂蛋白9 DNA通过结肠直肠癌肿瘤细胞变异,而不是正常的肠道细胞。变异的胞裂蛋白9 DNA由结肠直肠癌肿瘤细胞进入到血流中,并随后在血液样品中被检出。Epi proColon是一种在临床实验室内执行的遗传DNA试验。而Cologuard是第一种基于粪便的结肠直肠筛查试验,该试验通过检测粪便中是否存在表示特定异常增殖的红细胞和DNA突变,确定是否存在癌症如结肠癌或癌前病变。结肠直肠癌发生在结肠(大肠)或直肠(连接结肠和肛门的通道)内。大部分的结肠直肠癌开始的时候表现为大肠或直肠肠壁的异常凸起或扁平组织增殖(息肉)。一些非常大的息肉称之为晚期腺瘤,这些非常大的息肉与较小的息肉相比更容易发展为癌症。使用粪便样品,Cologuard可以检测血红蛋白—一种蛋白质分子(血液的一种成分)。由于粪便从大肠运动到直肠,Cologuard还可以检测晚期腺瘤脱落的细胞DNA中与结肠直肠癌有关的特定突变。建议检测结果为阳性的患者接受诊断性结肠镜检查。这一试验让患者和医师拥有了筛查结肠直肠癌的其他选择。粪便血液检测是一个已经成熟的筛查工具,临床数据显示该试验与广泛使用的粪便潜血试验相比能够检测出更多的癌症。FDA批准了Cologuard不会改变目前结肠直肠癌筛查的实践指南,目前美国预防服务工作组(USPSTF)不建议将粪便DNA试验(也称为“排泄物DNA试验”)作为结肠直肠癌的筛查方法。在其他指南中,USPSTF建议存在结肠直肠癌一般风险的50-75岁的成年人使用粪便潜血试验、乙状结肠镜检查或结肠镜检查筛查结肠癌。经过筛查了10023名受试者的临床试验后,Cologuard确定了其安全性和有效性。该试验比较了Cologuard和粪便免疫化学试验(FIT)—一种常用于检测粪便中血液的无创筛查试验的性能。Cologuard准确检测癌症和晚期腺瘤的性能比FIT试验高。Cologuard检测出了研究人群中92%的结肠直肠癌和42%的晚期腺瘤,然而FIT筛查试验仅仅检测出了74%的癌症和24%的晚期腺瘤。与FIT相比,Cologuard鉴别结肠直肠癌和晚期腺瘤呈阴性的受试者的准确度要差一些,Cologuard能够准确得出研究受试者中87%的阴性筛查结果,但是FIT则能准确得出研究人群中95%的阴性筛查结果。日前,联邦医疗保险和医疗补助服务中心(CMS)提出倡议在全美范围内覆盖Cologuard。CMS提议每3年向符合如下标准的医疗保险受益人覆盖一次Cologuard试验:标准1:年龄50-85岁;标准2:无症状(没有结肠直肠疾病症状或体征包括但不限于下部胃肠道疼痛、便血、愈创木脂粪便潜血试验阳性或粪便免疫化学试验阳性),以及标准3:存在发展为结肠直肠癌的一般风险(无腺瘤性息肉、结肠直肠癌或炎症性肠病包括克罗恩病和溃疡性结肠炎个人病史;无结肠直肠癌、腺瘤性息肉、家族性腺瘤性息肉或遗传性非息肉性结肠直肠癌家族病史)。本期刊登的《胃肠微生物群和结肠癌》一文说,近来许多研究尝试寻找在肠道活动的微生物、了解这些微生物的功能并探究其与结肠直肠癌(CRC)之间的联系。肠道微生物群驱使结肠内与结肠内肿瘤的发展有关的炎症的发展。尽管微生物群参与癌症发展的精准机制仍然不明,但是呈现出来的信息却非常明确:微生物群通过影响关键的宿主进程数量对癌症发挥着促进作用。目前已经认识到我们可以控制营养的摄入,影响肠道微生物群的作用。大量的研究将肠道微生物群与结肠癌症的发展联系起来,指出其具有和特定病原体一样的肿瘤促进作用,而且集体微生物群也有这样的作用。这强调了实际上与现有的报告相比,更多的癌症的发生都至少有部分微生物因素。理解肠道微生物群以及肠道微生物群促进健康和诱发疾病的机制是一个连续不断的研发领域。在CRC方面,更加完整地理解肠道微生物群对CRC发病机理的促进机制将为我们开启CRC防治的新道路。另外本期专刊还刊登了《肿瘤学临床实践指南(NCCN指南)2017年第二版》(结肠癌——检验相关部分)。


在《输血》专刊中,《分析前变量影响生物库中人类生物样本的完整性》一文指出,多种因素影响临床生化的最终结果,例如分析前生物或环境变量、分析前技术变量、分析变量及分析后变量。分析前变量就是影响生物样本完整性及随后研究结果的处理因素,无论是系统的还是随机的,它都可以引起体外修饰,从而反向影响最终结果。当研究结果偏离预期,我们通常质疑结果的分析完整性,而不是分析前完整性。即使研究分析方法完美,也可能得到错误的结果,临床化学实验室发生的误差大多归结于分析前误差,分析前误差可导致错误的研究结果或系统性偏差。由于研究的质量取决于生物样本的完整性,所有评估和控制分析前处理是将来最佳利用生物样本的基础。所有生物样本应当视为生物危害品,并且所有涉及生物样本的操作应当遵循实验室安全总则。队列研究收集生物样本是样本大小、数量与样本类型、自然增长率、位置、花销、运输物流和储存设备之间的平衡。最终的参与率依赖于对参与者的合理要求。一类应用生物样本的研究,其处理流程并不总是适用于其他类型的研究。因此,决定收集特定用途的生物样本的类型和大小,影响着后续所有的分析及逻辑。收集生物样本可以是有创的(如:血液)、微创的(如干血滴DBS),或是无创的(如尿液、唾液),血液、唾液和尿液是临床分析常用的。微创和无创方法的使用,使得珍贵的血样使用量最小化,并且由于减少花销、无需特殊人员、收集方便、受试者更愿意捐献样本等优点,从而增加研究总体的样本量。患者是否愿意捐献生物样本,对于儿科生物库来说尤为重要。生物和环境因素同样影响研究后续结果分析,这些因素的总变异可能会影响分析物的表达水平。因此,将这些因素标准化、详细记录,并在解释或比较或合并研究结果的时候纳入考虑范围内,就显得尤为重要。每隔一段时间对相同个体进行重复检测可减弱分析前和分析变异的影响。也可进行较长时间间隔的连续性检测,以获知随着时间的延长而发生的变化和影响。在临床化学实验室,与生物样本交接相关的分析前变量同样会影响样本的数量或质量(比如:错失、错误、或重复收集,数据入库差错、错误的患者或样本编号、样本量不足、样本稀释、贴错标签、样本丢失)。另外,没有知情同意、忘记或丢失知情同意书、有限制性知情同意的生物样本,其分析获得的价值也是有限的。接着论述了血液、尿液和唾液样本的采集和加工处理。关于生物样本运输,本文指出生物样本运输包括从部门间到国际运输的所有运输方式。错误的包装、标记、分类、标签或是错误完成运输文件记录都会引起延误或海关拒收,由此就可能影响生物样本完整性。运输过程中影响生物样本完整性的变量有:季节、运输时长、延误、距离、运输方式。国际运输特别容易在清关时延误。运输过程中可用电子设备追踪和监测温度。建议不要把所有的收藏品或是相同的样本放在一起运输,而是应该运输少量收藏品,并总是分开相同的样本。运输全血、血浆、血清、白膜层、尿液、DNA和RNA需要冷藏设备、冷冻机、特别包装、干冰,甚至是价格较高的运输物流。多日运输的话,准备足够的冷却材料至关重要。所有的管子都应保持垂直、向上、旋紧盖子放置,这对血样管特别重要,因为这样放置可以减少溶血发生,并且对非抗凝管,可防止纤维蛋白接触管盖。轻柔操作减少样本晃动的几率,从而减少溶血发生的风险。长距离运输应该使用防震转运箱。DBS应在采集后24小时之内,室温运输至实验室。血液、尿液、唾液、DNA或RNA通过商业运输可能会遭遇极端的季节性气候,长期大规模的跨国研究应考虑到这些因素。需运送至处理室的样本不能用于研究极其不稳定的生物标记物,或者在运输前处理,以保证运输途中的稳定。关于长期储存和复苏,依据样本将来的用途,决定短期还是长期储存。同时应确定生物样本是否就地保存、集中保存或是都有。这些取决于多种因素,比如:样本大小、自然增长率、采集和处理过程的复杂程度、物流、花销、质量问题以及生物样本库管理因素。如果样本适用于多种研究,推荐将样本副本放置在靠近中心实验室的地方,以便实践。若是计划储存样本超过一年,建议将样本储存在中央库房。同时推荐将副本放在不同电路供应的设备中,或是不同的地理位置,以抵抗设备故障或是自然灾害,还需要一个或多个备用冷藏设备(推荐设备是空的)以防设备故障。依据后续分析物的不同,可使用多种储存条件。最需要关注的问题就是冻融次数,可能是冰冻样本在运输过程中无意间发生的或是冷藏设备故障,也可能是因为单管分装的样本反复使用,再放回冷藏设备中而引起的。具备可追溯性、位置监管和生物样本管理的LIMS(实验室信息管理系统)改善了样本检索和数据的可靠性。生物样本是极其珍贵且难以替换的,如果样本完整性破坏,那就无法用于今后的研究。因此,检索样本最重要的就是只检索需要的,使得需要量降至最低。为防止所有库内生物样本彻底毁灭,推荐在其他地方放置样本副本。本文最后总结说,用于诊断或预后的个性化医疗中,生物样本的分析前处理是未来使用的基础。对于生物标记物探索和开发,分析前需求和文件与生物标记物临床表现评估的分析需求同等重要,特别是需要美国食品和药品监督管理局批准的时候。如果分析前步骤做不好,那么也没有必要检测生物样本了,因为其后续实验结果不合格。分析前决策应根据对后续分析的潜在影响而制定。分析前最佳实践和SOPs都应循证而定,且在研究开始前开展试点可行性分析。研究步骤应根据BRISQ或是其它最佳实践指南详细描述分析前流程。应充分考虑分析前变量,在研究中作为协变量一同分析,如:年龄和性别。比较或合并多个不同研究中的结果时,研究者应考虑分析前条件的差异。本期刊登的《生物样本库的质量管理》一文指出,生物医学研究人员需要高质量的人体组织来支持他们的研究,因此生物样本库获得组织的一个重要方面是确保高质量和处理样本的一致性。实现这一目标最好的方法是建立质量管理体系(QMS)。本文阐述了有助于改进生物样本库运营的QMS程序的基本原则。关于组织样本使用中的偏倚,本文指出使用人类组织进行研究,其变异性部分是由偏倚引起的。当混杂变量是观察的原因而不是被研究的变量被归因于观察时,偏倚发生了。生物样本库应当了解提供的组织特性引起偏倚产生的潜在原因。了解偏倚应尽量减少组织分析导致偏差结果和结论的可能性。具体来说,测量从病例(患者)获得的组织与从没有疾病的个体获得的组织(如对照组)可能会有差异;然而,差异可能是由混杂变量引起而与被评估的疾病相关问题无关。因此,这些混杂变量会导致偏差,并可能导致错误的解释,即疾病患者组织的实验差异是由于疾病导致的。混杂变量可能包括人群不匹配差异(例如,比较一个年龄范围为[50-80岁]与对照组的不同年龄范围 [20-40岁]),采集(例如,冷缺血时间不同),处理(对照组70%乙醇固定,病例组10%的中性福尔马林缓冲液固定),贮存(-80℃与-20℃比较),样本分发(蓝冰运输与干冰运输比较)或实验程序上(例如,一批疾病样本在一天内分析的,一批对照的样本一周后分析)。当实验结果不能被重复或/和验证时,偏倚通常被识别。没有详细和准确的记录,偏倚可能很容易地被引入到研究项目中且不正确的结论可能作为对研究成果的解释而被接受。例如,如果CDC的DLS没有常规执行采集/处理/贮存/分析材料的预筛选,大量污染的试剂被不知不觉地用于痕量金属和其他超低浓度分析物如人血清中的二恶英,就会发生污染导致的偏倚。通常在同一研究中有多种引起偏倚的潜在原因,因此,不能识别特定的有问题的混杂变量。例如,用手术前(空腹)采集的EDTA血浆来评估疾病的分子特征,样本在-80℃贮存超过10年且期间经过多次冻/融,但EDTA对照血浆贮存在-80℃不到一年,只冻融一次,采集于移动车在社区环境下的非空腹志愿者,多种方法可以识别由这些样本差异所引起的分子差异,且可能发生偏倚的结果。同时,这些事例强调了使用详细的标准操作规程的重要性,且覆盖不同采集地点的SOP要标准化,因此要采取统一的方法进行组织的采集、处理,贮存和分发。任一多站点的长期研究绝对要求方案和标准操作规程的连续性。重要的是详细记录能突出样本的差异,在报告结果前,结论的确认可使用统一采集、处理、贮存和分发的一小部分样本。即使非常小心,点与点之间还有可能存在偏倚,所以确保每个点的对照数与病例的数相同至关重要。关于生物样本库的模式,本文指出在不同模式下运行的生物样本库,其质量管理体系的某些方面可能会有所不同。具体来说,获得人体或动物组织和/或体液用于生物医学研究可能是有组织性的或无序的。“能收集什么就收集什么”最好地描述了一个无序的模式,即通过病理学家,医生,兽医,或其他人随机收集组织用于未来的研究。一般情况下,这些样本的采集,处理,贮存或分发没有使用SOP,通常没有包括质量控制的质量管理体系;因此,这些样本常常质量差且样本的诊断可能是错误的。更多关注的是此类样本的获得可能没有机构审查委员会(IRB)的监督且可能违反法规,如仅适用于美国的健康信息隐私和可携带性法案(HIPAA),尽管其它地方也可能使用类似的隐私法规。同样,专门为获取组织而处死动物的项目,应在动物使用委员会的审查下进行。同时,任何可识别的个人健康保健信息的信息项目必须符合医疗保险可携性和责任法案(HIPAA)的严格要求。大多数有组织的生物样本库采用下列的模式之一:1)的“贮存库”模式,是遵循SOP采集、处理、贮存和分发一种特定的组织(如乳腺癌)或广泛的组织(例如,任何癌和对照)进行采集、处理、存储和分发遵循SOP。2)临床试验模式。3)流行病学/基于人口和环境的模式是贮存库模式的子类型。4)前瞻性模按照研究者需求采集,处理和分发组织的。5)前瞻性加贮存库的组合模型,样本既前瞻性收集和/或被贮存;UAB的生物样本收集和贮存研究所目前采用该模式。该模式的形成不仅基于生物样本的采集和分发,而且还提供生物样本的一些分析数据。是否能够获得特定分子在生物样本贮存中降解的数据,此模式是具有优势的。一个有组织的贮存库模式,运用SOP采集、处理、贮存、分发组织。通常情况下,组织样本库只贮存冷冻组织,固定的组织,稳定的组织制备和/或石蜡块。特定方法处理的组织(例如,在10%的中性福尔马林缓冲液固定 [10%NBF])和新鲜非冷冻或未处理的样本通常是无法从一般生物样本库获得。例如,大小、肿瘤范围,及特殊处理可能无法满足研究者的具体要求。贮存库有着立即获得多种生物样本的优势。样本库的另一个优点是,通常可在需要样本的同时获得临床信息;大多数样本库的肿瘤允许“到期”,直到分发前可获得结果数据。或者,部分库存样本在采集时进行分析,并在患者转归前获得结果。不幸的是,许多组织样本库不注重样本在研究中的使用,这对于严格的贮存库模式几乎是致命的缺陷。具体而言,大部份存进样本库的组织从未用于研究。这对于长期甚至1年或2年贮存过程中,特定分子的降解更加复杂。这已经成为一个伦理问题,捐赠者默示的承诺是他们捐赠的组织将用于支持生物医药研究。这也导致了一个非常低效的模型,通常不能实现低成本高效益。临床试验模式是贮存库模式的一个子类型,贮存来源于一个或多个临床试验剩余的体液/固体组织,以支持可能与原来的临床试验无关的未来研究。临床试验模式有着贮存库模式所有的缺点;此外,病人临床试验的知情同意可能没有表明临床试验后剩余样本可用于其他的研究类型。因此,伦理审查机构可能阻止此类样本用于不同于他们曾同意的研究类型。流行病学/基于人口/环境模式通常关注回答特定或未来的问题,通过选择患者或志愿者代表一个人口或亚群的统计样本来实现。具体来说,如果需要回答一个特定的问题,按照SOP从志愿者人群收集组织和全面的信息。样本通常是体液样本,且样本与直接从个体获得的大量注释相关联。这种模式和贮存库模式有许多相同的缺点。例如基于流行病学/人口和环境模式是美国健康及营养状况调(NHANES)研究前列腺、肺、大肠和卵巢(PLCO)癌筛查试验以及英国生物样本库。大肠和卵巢(PLCO)试验涉及许多年收集纵向体液样本,目的是获得一个或多个器官肿瘤发生前的样本。英国生物样本库一个有趣的方面是部份样本的内部分析类似于美国健康及营养状况调(NHANES),因此数据和样本都可以在这个机构获得。前瞻性收集是生物样本库的一种模式,研究人员专门确定所需组织(例如,诊断和大小)并指定样本如何采集(例如,仅来源于空腹患者),处理(如冷冻),贮存(如在气相液氮中),分发(如干冰上运输)。前瞻性模型的缺点是在需要时,样本不能立即可用,临床结果也不能获得----可能在样本收集之后的数年后才能获得。此外,罕见的样本对于前瞻性的样本库是一个难题。前瞻性收集模式的优点是提供的组织专门针对研究者需求(如新鲜的、不冷冻的、乳腺导管内癌切碎在加有抗生素/抗真菌药物的DMEM培养基中)。前瞻性收集模型的一个非常重要的方面是几乎所有收集的样本都用于研究,所以它非常低价且高效的。例如,人类组织协作网(CHTN)自1987年以来已分发了超过100万份样本,3300多位研究者发表超过3700多篇文章。此外,前瞻性收集的样本因贮存引起的分子加工品的降解最小化。虽然许多组织样本库不专注于他们的样本在研究中的利用,组合模式的组织收集和贮存结合了前瞻性和贮存库的模式,通常包括这两种模式的优点和极少的缺点,但是,需要有复杂管理,包括需要一个更复杂的生物信息系统。要有高质量和一致性处理的组织分发给研究人员,每个有组织的生物样本库模式都需要质量管理体系(QMS)。关于固体组织的质量控制,本文指出用于研究的组织质量监测和诊断(即质量控制)是质量管理体系的重要组成部分。为了确保提供的组织和相关信息满足研究人员的需求,生物样本库已经使用了各种QC来帮助他们。许多组织尤其是肿瘤是异质的;因此由于肿瘤细胞、黏蛋白量,纤维化/结缔组织增生,正常细胞,炎症细胞和/或坏死的程度不同肿瘤样本呈现多样化。可能混杂在肿瘤中及其邻近的纤维化或在大体检查中被误认为肿瘤;同样,某些肿瘤广泛浸润正常组织,使肿瘤区域的识别非常困难。因此,仅了解一个样本(此样本切割成多个等分)的病理诊断对于研究用实际组织的QC是不够的。对于浸润性肿瘤如乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌和肉瘤以及典型的大面积坏死,如肾细胞癌和结直肠癌肝转移尤其如此。同样,仅根据外科病理报告对于肿瘤或有广泛炎症的正常组织进行诊断也是不够的。具体来说,许多正常和未受累及组织可能有局灶性淋巴结炎症混杂在非肿瘤组织中,同样,肿瘤细胞可混杂在炎症以及正常细胞中。这两种模式(对照组与癌症)使得一些检测复杂化,除非研究人员意识到这些模式。在UAB,提供给研究人员的每份组织样本的最低程度质量控制(QC)至少有准确的诊断,和病理医生对镜检的详细描述。对一些站点而言,这种方法可能过于昂贵。在这种情况下,H&E切片或其数字图像可以保存在文件中,以确保样本用于研究时具有准确的描述。质量控制检查也可能包括分子分析、RNA、DNA、蛋白质和/或其他分子从代表研究用样本的小等分样本中抽提,并表征这些分子的特定类别,如果研究人员要求这一级别的QC,可进行质量控制,但研究人员通常需要支付相关增加的费用;此外,机构对提供的样本分子分析定期进行质量评估,作为该机构全面质量保证计划的一部分。现在ISBER可提供能力验证试验有助于QC的特定检测,组织库有一个“价格”包括增加的时间和精力,也增加了研究人员所需样本的成本。QC也可以根据个别研究人员的要求量身定制。“白金”水平的质量控制可能包括样本的大切片提高样本中肿瘤的比例。在此方法中,整个样本制作成冰冻切片,然后对样本的一面或两面进行大切片丰富样本的病变细胞。另外,从大切片样本可以进行分子分析。同样,大切片也可以是基于石蜡块进行石蜡切片的。这两种方法增加了样本处理的成本,也降低了因QC消耗所需的组织样本;然而,这种方法的成本要比激光捕获显微切割少得多。如果研究项目不要求或需要这样广泛的质量控制,这种形式的QC可能不符合成本效益且更简单的方法可能是足够的。另外,在研究机构的病理学家可以对提供的样本进行附加的QC和/或大切片。mRNA质量有时是从冷冻组织切片抽提RNA,通过检测如RIN和/或降解因子进行评价。显然,如果样本不用于RNA分析,RNA水平的QC分析会增加不必要的成本。在这样的分子分析中,大切片和/或了解恶性细胞的比例对分析更为重要。注意,在逆转录实时定量PCR技术中使用短扩增子(<100bps)允许使用降解的mRNA,甚至使用从蜡块中提取的mRNA可用于分析且给出的结果与从冰冻组织中获得的等效。运用QC,TCBF已经发现采集的样本约有15%-20%典型的肿瘤样本不能用于研究。此外,对一个特定的组织收集实例库“能收集到什么就收集什么”且无初始质量控制的组织库而言,在评估收集的肿瘤样本时发现超过50%含肿瘤小于10%。具体地说,一个组织的等分样在肉眼检查时没有肿瘤可能在显微镜下有癌细胞;相反,在肉眼检查时是肿瘤样本,由于纤维化或疤痕和/或粘白可能不包含足够的恶性细胞。一个切分的组织样本被拒绝用于具体研究的其他原组织是因为QC检查包括广泛的缺血、炎症、坏死或手术损伤(如烧灼物)。例如,一些大的或转移性肿瘤(例如,大肠癌肝转移)的局灶性区域可能由于坏死,以致无法识别残留的肿瘤细胞。在最低限度的QC检查,特定疾病样本的比例(%)。例如,对于肿瘤,肿瘤纤维化和粘蛋白以及坏死的百分比应当与称为“肿瘤细胞”或“肿瘤核”,更准确地被称为“恶性核”的恶性细胞比例一起被详述。具体而言,一种黏液性肿瘤可能是由大于90%的细胞粘蛋白组成,恶性细胞表达不足可能阻碍许多具体的分析方式。一般来说,因为肿瘤可能被大量炎性细胞浸润和/或可能含有其他非恶性细胞,因此恶性细胞的分子可能被严重稀释,所以,恶性肿瘤内细胞的比例可能会有很大差异。同样,难以确定特定细胞产生的分子(如microRNAs)。通常,对冰冻切片而言,组织样本包埋在冰冻切片的支持介质中(例如,最佳切削温度[OCT]化合物)OCT或其他类似的浓酒精冰冻切片支持介质。重要的是,OCT可能污染样本表面,随后干扰如质谱法或生物测试的一些分析。关于体液及其他液体样本采集的质量保证/控制,SOP的建立是获得高质量的体液样本支持生物医学研究的一个关键。纳入SOP的应被确定为采集、处理、贮存和分发生物和其他液体的重要参数。该SOP的首要方面是所有体液样本应尽快操作迅速冷冻,并记录采集和冷冻之间的时间;特别是血液、尿液和唾液的存储一般应在采集后4小时内。然而,这个时间的重要性随分析物不同而异且没有足够的研究支持笼统的概述。样本应保持在湿冰温度(4℃)直到处理和/或存储,除非特定的使用需要室温(例如,淋巴细胞的永生化或血清凝固)。就血液成分而言,在一般情况下,样本不应该溶血,因为溶血释放蛋白水解酶以及大量的蛋白质(如血红蛋白)。再次,减少溶血的重要性因分析物不同而异。因此,如果能够控制,采集针不应小于23号,流速不宜太快或承受太大的压力。此外,如果必须避免溶血,血液分离前不应该被冻结且没有添加剂。需注意的是并非所有的检测都受到溶血影响,如DNA。所有其他方面的相关标签,初加工,和体液的贮存应纳入SOP。同样,也应记录存储条件。最后,在分发体液样本前,如先前所讨论的,应考虑使用体液样本研究所涉及的偏倚。本文最后总结道,生物样本库必须建立一个强大的QMS,以便为研究人员提供高质量、一致性的组织和相关产品进行生物医学研究。否则,资源可能被研究人员延伸到研究质量差、诊断不正确、或有偏倚的组织,所有这些都可能会延迟一个特定研究项目的进展。此外,质量差的组织会导致人为的和/或误导性的结论,从而发表的结果无法重复。没有高质量的组织,生物医学研究深受其害。因此,关键是生物样本库要有计划地促进样本的分发以协助研究人员的研究。生物样本库的领导层应该认识到,他们在研究机构起着至关重要的作用,这可能涉及对研究人员在人类组织的使用、局限性和潜在偏倚方面的教育。我们敦促所有生物样本库认同强大的质量管理体系QMS与QC在经营中的重要性。本期刊登的《关于血液和尿液样本采集、处理和存储的方案——英国生物样本库(UK Biobank)》一文介绍,英国生物样本库(UK Biobank)采取前瞻性流行病学策略,在中老年人群中研究基因、环境和生活方式与常见病的关系。该方案的目的是阐明在额定的经费支持下获取最大的科研价值的建库,该库所采用的样本采集、处理和存储方法,来确保样本质量,为后续开展的现有或可预判研究实验服务。该方案的制定借鉴了大量已有文献、咨询了相关专家并进行了同行评议。该方案内容涉及样本的采集种类、处理方法和时间以及存储条件等问题,来确保样本长期存储的质量。对于每位捐献者,该样本库采用真空采血管采集45ml的血液和9ml的尿液,并在现场进行最小程度的处理。对于样本保护剂、抗凝剂和促凝剂的选择将根据预期的用途来选定。该样本库也在部分捐献者中收集了头发、指甲、唾液和粪便等样本。血液和尿液样本将在24小时之内从现场运送到存储中心。样本将在那里进行处理,处理后的尿液、血浆、血清、白细胞和红细胞会存储在超低温容器中。全血的部分分样也进行了保存,即保留其潜在的细胞系。部分样本用于标准的血检(因为这些检测项目必须使用新鲜血样)。最终,将收集到15000000份样本,其中9500000份样本存储在-80℃自动化设备中,另外的5500000份样本存储在-180℃液氮中。基于研究中涉及的样本数量巨大,该方案中采用了大量的自动化手段。其中涉及的流程、技术、设施和设备等都采用了最佳实践。鉴于记录样本采集、处理和存储的数据量是繁琐的,该方案采用商业化的LIMS系统来统一管理这部分资料。结论认为该库采用的样本采集、处理和存储方案不仅满足了本研究的需求(样本量巨大),并最大限度的确保了样本的质量。从第一批次40000人次的实践来看,已展示这套方案是合适的、可靠的。本期刊登的《西班牙肾脏病研究系统(REDinREN)生物样本库样本质量保证(QA)与处理过程》一文提到的西班牙肾脏病研究系统(REDinREN)生物样本库,其内储存着来自西班牙全境内70余家肾脏病中心、涵盖了多种类型肾脏疾病、约5,450位患者的76,500份新鲜冻存样本。参照ISO 9001:2008 国际标准,严格对西班牙肾脏病研究系统生物样本库内所储存样品的储存条件以及样品处理流程进行质控分析,并报告质评结果。采用了两种质评方法:(1)系统性的,即提取外周血单核细胞(PMBC)并纯化细胞核酸,检测该提取方法的可行性;(2)ad-hoc,即检测所提取的冻融PMBC的生物活性,验证DNA提取过程的可重复性,以及所提取核酸的完整性和核酸功能。结果证实,采用Ficoll细胞密度梯度离心方法分离纯化PBMC,其分离效果具有可重复性,冻存的PMBC生物活性大于90%以上,而且大部分提取的DNA(2,328例)和RNA(78例)样本A260/280比率显示纯度适宜。采用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的完整性,聚合酶链式反应(PCR)扩增得到β球蛋白长度分别为1327bp和989bp的两个片段。 DNA质量保证的标准是PCR扩增至少获得β球蛋白三个段带。进行RNA完整性检测,96例样本中87例RNA样本完整性系数(RIN)大于7以上。进一步通过QPCR及RT-PCR检测了β-actin和GAPDH的表达,验证前期PCR扩增的正确性。样本长期保存及操作过程中时间延迟并没有影响检测样本的质量,所得的实验结果均具有可重复性。结果表明,他们所保存的外周血单核细胞样本、提取的DNA、RNA样本质量均达到质控标准并能满足生物研究的需求,并能够长期保存。本期刊登的《生物样本库的成熟:向生物样本科学的转变》一文首先讨论了生物样本库的定义。生物样本库工作包括物理设施和数据系统两类,物理设施是存储生物样本和数据的基础物理设施,数据系统是管理生物样本库的各类规范和流程。生物样本库是目前常用的术语。然而很难对其进行精确的定义。Hewitt & Watson等人的问卷调查显示在对生物样本库进行描述时,会有不同的看法。这些看法反映了现有生物样本库在规模和目的有很大的不同,从小型病理实验室——只有几台冰箱,仅收集石蜡切片,到大型机构或商业的生物样本库——有几百台冰箱、各种自动化设备、健全的安全设施和完整的质量管理系统。另外,生物样本库中样本的使用目的也不相同,包括基础实验、转化医学研究、流行病研究和临床研究等。以上这些情况,导致产生了许多不同的最佳实践,从而能够满足各种目的,进而产出各种样本和数据来满足质量要求和下游分析的需求。关于生物样本库最佳实践的发展,本文指出随着生物样本库变的越来越大、越来越复杂,其中的样本、数据的种类和数量也越来越多,一些机构已经发布的一系列权威的最佳实践。国际生物和环境样本库协会(ISBER)已经与2005年发布了其第一版的最佳实践,随后进行了两次修订,目前最新版发布于2012年。美国国家癌症研究所(NCI)、国际癌症研究机构(IARC)、经济合作与发展组织(OECD)等均已发布了相关最佳实践。一些综述已经简要概括了各类最佳实践的发展。一般来说,最佳实践中的各类文件是根据大型机构或商业生物样本库的经验编写的,这是因为这些样本库有完善的质量管理体系、信息系统和各类生物样本的流程。随着生物样本的存储已经成为一种科学,发展基于证据的标准操作流程并融合到最佳实践已成为趋势。Engel等人研究了美国国家癌症研究所(NCI)发展最佳实践的过程并举了一个术后组织快速冰冻的例子。一般来说,生物样本库的技术和操作实践已发展为供大多数的技术和操作遵循相似或相同的流程。目前最佳实践和其他发表文章都提供了各类样本(包括血液、组织、尿液、唾液、及其他各类样本),在采集、处理、贮存和运输中的各种详细建议。流行病学研究中所涉及的生物样本的收集还需要各类的标准操作流程。新的样本类型和技术还需要定期的调整和不断更新的标准实践。在“询证实践”章节中,还会提到在选择生物样本采集、处理和贮存的的最佳方法中,鉴于各种处理前变量和可能的偏倚,还有许多没有解决的问题。伦理、法律和规则的实践还有待解决,其中还有很多存在争议的地方(参见伦理、法律和社会问题)。这些问题还受到地区和国家的政策的影响,而这些政策使生物样本和数据的国际化共享变得更加复杂。随着各种最佳实践的衍生和生物样本库数量、复杂型的增加,研究者就会提出一个问题——是否需要建立一个国际化的、包罗万象的最佳实践。在2010年,一项关于国际化生物样本库最佳实践的综述列出了已经有14个组织发表了最佳实践。这些实践提供了多种多样的建议。鉴于以上已经列出的原因,这种情况很难解决。因此采取和发展循证实践就变得至关重要。国际生物和环境样本库协会(ISBER)和其他国际化生物样本库组织正致力于培训生物样本库专家,促进生物样本库向国际化、一致化发展。一个很好的例子、未来的方向,就是欧洲生物体样本库与生物分子资源研究设施(BBMRI)。该组织由欧盟资助,联合各方面的力量,致力于欧洲及其他地方生物样本库的可持续发展。该组织的项目包括主办和参与各种与生物样本库相关的研讨会和培训项目、发展各种培训材料,从而促进生物样本的国际化交流。关于生物样本的质量,本文指出在生物样本科学发展的过去10年中,参与者从一些有影响力的失败的案例中学到了很多宝贵的东西,集中于生物样本的处理和质量问题。正如Spruessel等人的组织缺血时间对基因表达的影响的研究中提到的,“尽管科研工作者控制各种变量,尽力试图减小其对结果的影响,可是,他们通常很少知道临床样本的背景情况”。在美国国家卫生研究所的一个项目——The Cancer Genome Atlas中,出现一些早期样本质量失败的情况,因为从已经收集的冰冻组织中回顾性地收集的肿瘤标本没有满足相关的病理及分子质量的要求。超过一半的原始收集的样本没有满足相关质量要求。最终,该计划的领导者决定采取前瞻型的收集方法,并采用严格控制的标准程序。这样使样本的合格率超过80%。在建立乳腺癌的治疗标准方案中,研究者检测HER2基因来探究曲妥珠单抗治疗是否有效。在2007年,美国病理学会(CAP)和美国临床肿瘤学会的一个专家组发表了一个有关临床实验室间HER2异质性的大型综述研究发现,Her-2的假阳性率和假阴性率高达20%。在其发表的文章中,专家提出HER2检测的问题有一部分就来自与乳腺癌生物样本固定方法的不同。尽管已付出了相当的努力来编制有关样本科学的综合文献,研究者还是发表了很多分析前变量影响生物样本质量的例子(本综述后面也会谈到),参见Khoury和Hewitt 等人的例子。Poste强调发展新方法消减处理前变量的对样本影响的重要性;Ransohoff 和Gourlay指出生物样本的处理不当会带来一定的研究偏倚。这些影响除了分析前变量,还包括在分析样本中batch effect(因为处理的样本量大,小的影响会被放大,带来严重影响)和样本来源的不同(例如来自于实验组和对照组)。关于质量管理体系,本文指出伴随着生物样本库最佳实践的发展和生物样本科学的进步,建立质量管理体系已经成为生物样本库行业中的重中之重。目前,生物样本库的工作中已经采用了临床化学实验室的成熟的质量检验和质量控制体系,另外的专门针对生物样本库的实践。生物样本库的基本质量管理体系需要工作中的各个方面各种标准操作流程(SOP)。工作人员需要进行SOP的培训,流程需要进行周期性的内审和外审,以及需要一个电子文件存档控制系统。ISBER、NCI、OECD 及一些别的组织的最佳实践中对基本的生物样本库的质量管理体系已有描述。随着生物样本库和生物样本科学的发展,质量管理体系也发生了变化。早期采用质量管理体系的都是临床用的生物样本库,受到FDA的监管。这些质量管理体系均是根据GMP制定的。GMP对SOPs、安全措施、设施的安装、运行及维护文件、IT系统和对所有样本和试剂的记录均有严格的标准。最近一些生物样本库,特别是从事国际合作的生物样本库,已经根据ISO进行了质量认证。所采用的ISO标准是ISO9001。但是,ISO9001是一个综合性的质量管理体系,而不是专门的生物样本库管理体系。目前,ISBER和其他组织已经组织了专家在进行生物样本库专门的ISO建设。所有ISO认证活动都有助于生物样本向更高质量管理标准的发展。本文还讨论了循证实践的方法以及文章发表准则。文章最后总结说,生物样本的存储工作在过去的几十年见已经发生了很大的改变,由过去病理部门的一个分支——用来收集石蜡和冰冻标本,转变为涵盖多学科的生物样本科学新领域。生物样本科学也有很大的发展,从由生物样本采集和处理的实践中总结出最佳实践,到控制分析前变量、发展循证实践进而促进生物样本库全球化发展。还有其他一些因素影响生物样本行业的成功与否,包括伦理、法律和社会因素,经济因素,IT技术,质量管理体系和相关的培训、资格认证项目。


在《免疫》专刊中,《利用心电图和基线高敏肌钙蛋白I立即排除急性心肌梗死》一文中,研究者评估了一次入院测量具有较低临界值的肌钙蛋白结合低风险心电图(ECG)排除AMI的性能。在1040名入院时出现疑似AMI的患者中使用高敏试验(hs-TnI)测量的肌钙蛋白I(BACC研究)。为了排除AMI,研究者利用最佳的hs-TnI临界值结合低风险ECG的方法计算了阴性预测值(NPV)。在3566名疑似AMI患者中确认了该结果 [利用当代肌钙蛋白作为唯一生物标志物,通过2小时加速诊断方法评估胸痛患者的研究(ADAPT)]。对患者进行6个月或12个月的随访。结果:184名患者诊断为AMI。hs-TnI临界值为3ng/L时得到的NPV为99.3%(CI97.3-100),排除了35%的非AMI患者。增加低风险ECG信息后得到了100%的NPV(CI97.5-100)(排除了28%的患者)。2个确认人群重现了该方法的高NPV。排除人群的随访死亡率很低(BACC和心绞痛人群0死亡,ADAPT研究1死亡)。最后得出结论,入院时进行1次hs-TnI测量结合低风险ECG似乎可以在无需连续肌钙蛋白试验的前提下排除AMI。《利用单一高敏心肌肌钙蛋白I测量快速排除急性心肌损伤》一文介绍说,美国以外进行的研究中在选定的存在胸痛的患者人群中利用高敏心肌肌钙蛋白试验快速排除策略得到了广泛的支持,但是这不是美国国内的正常做法,使用这种方法专门侧重排除急性心梗(AMI)而不是更常见且预后更差的急性心肌损伤。对进入急诊室的患者的连续前瞻性和观测性[推导(n=1647)和确认(n=2198)]研究,根据临床迹象测量高敏心肌肌钙蛋白I(hs-cTnI)。为入院患者的急性心肌损伤和AMI或30天的心脏死亡测定低于检测限(LOD)的hs-cTnI浓度和阴性预测值(NPV)。结果:入院时hs-cTnI浓度低于第99百分位数的患者推导和确认人群AMI的发病率分别为8.3%和11%。在推导人群中,27%患者的hs-cTnI低于LOD,NPV和急性心肌损伤诊断灵敏度分别为99.1%(95%CI,97.7-99.8和99.0%(97.5-99.7),30天心脏死亡或急性心肌损伤的NPV为99.6%(98.4-100)。在确认人群中。22%患者的hs-cTnI低于LOD,NPV和急性心肌损伤诊断灵敏度为98.8%(97.9-99.7)和99.3(98.7-99.8),30天心脏死亡或急性心肌损伤的NPV为99.1%(98.2-99.8)。结论:无论病因学结果如何,仅凭低于LOD的hs-cTnI浓度排除就可以排除AMI,该方法具有卓越的NPV和诊断灵敏度,鉴别具有最低AMI或30天心脏死亡风险的患者。本期刊登的《急诊科就诊时高灵敏度肌钙蛋白T的低浓度结果》一文提到,根据急诊科(ED)就诊时高敏心肌肌钙蛋白试验的低浓度结果进行排除诊断的若干问题尚待探索。首先,研究<第99百分位值的高敏心肌肌钙蛋白I(hs-cTnI;Abbott Architect)临界浓度的大规模分析,未能研究包括临床相关急性冠脉综合征整个范围的结局,称为紧急血运重建。其次,这些方法对高敏心肌肌钙蛋白T(hs-cTnT;Roche Elecsys)试验是否有效仍待研究。最后,在低临界浓度时实验室四舍五入(根据精确的小数点后数值将报告值四舍五入为最近的整数)对于诊断性能的影响,以及这又如何影响可能符合及早出院条件的患者比例都是未知的。在这次前瞻性招募群体的事后分析中,我们的目的在于使用检测限(LoD)和附加的<第99百分位值的临界浓度,以确定非缺血性心电图(ECG)患者的单一急诊hs-cTnT结果的诊断性能,以及实验室四舍五入的影响。初步分析的方法和结果以前发表过,包括对急诊科就诊时hs-cTnT在LoD时的诊断准确度的报告。对于年龄≥18岁、胸痛提示心脏缺血但显示非缺血性ECG的患者,治疗医生需要进行6-h肌钙蛋白检测;这些患者被前瞻性招募进入一个研究中心。针对这项分析,分析了从LoD(<5ng/L)到第99百分位值(14ng/L)的hs-cTnT结果,保留一位小数。在LoD到第99百分位值之间的所有临界浓度都将报告值四舍五入为最近的整数。试验结果不受先前报告的校准位移影响。结局是30天内出现重大不良心脏事件(MACE;由于缺血性心脏病造成的死亡,心脏骤停,紧急血运重建,心源性休克,心室性心律失常,高度房室性传导阻滞,和事故性/流行性急性心肌梗死)。共计包括922名患者。其中,546名患者(59.2%)是男性,平均年龄在58.0岁(SD=13.3),95名患者(10.3%)在30天内发生MACE。基准特征以前报告过。采用实验室四舍五入时,922名患者中210名患者(22.8%)的肌钙蛋白浓度<LoD(5ng/L),262名患者(28.4%)的数值没有四舍五入。四舍五入的LoD临界值对MACE的灵敏度是97.9%(95% CI,92.0-99.6),阴性预测值(NPV)99.0%(96.4-99.8)和阴性概率比(NLR)0.084(0.014-0.325)。未四舍五入的LoD临界值的性能几乎相同:灵敏度97.9%(92.0-99.6),NPV 99.2% (97.1-99.9),和 NLR 0.067(0.012-0.259)。对MACE的灵敏度随着临界浓度增加而降低。>LoD-≥14ng/L的四舍五入和未四舍五入临界值对MACE的灵敏度都<97%。在所有临界浓度,实验室四舍五入导致潜在适合及早出院的患者比例减少。这种影响只有在LoD时才达到显著,四舍五入后符合及早出院条件的患者人数减少5.6%;四舍五入22.8%(20.2-25.6)与未四舍五入28.4%(CI 25.6-31.4)。我们证明了利用临界值<5ng/L(LoD),急诊hs-cTnT能够鉴别20%以上潜在适合出院的患者。此临界值对于MACE结局的诊断性能可能低于临床可接受水平。但是,应该注意到MACE的复合结局包括血运重建,虽然很重要,但是主观结局。我们还证明了临界值>LoD从临床实施上来说可能诊断性能不够。使用LoD临界值时,实验室四舍五入可能显著降低潜在适合及早出院的患者比例。重要的是,我们没有分析症状发作后早期就诊的那些患者。低临界浓度的诊断性能属于这个亚组。此外,我们选择了没有被用于诊断缺血的新发ECG变化的患者。因此,与先前的研究相比该分析选定的人群很可能处于低风险,而诊断性能也因此被高估了。考虑到漏诊MACE的法医学意义,临床医生必须仔细考虑LoD临界值是否能够在临床实施。尤其是,当临床医生根据不可检测的肌钙蛋白做出院决策时,应该充分考虑距离症状发作的时间、进一步风险分层、和先进心脏检测的需要。利用高敏心肌肌钙蛋白的低临界浓度的方法是否能够成功地进入临床实践仍是未知的。需要进一步的研究来确定这些方法的临床效果和成本效益。


在《心血管疾病》专刊中,《预防心血管死亡》一文指出,随着一项成为“在风险升高的受试者人群中使用PCSK9抑制剂的进一步心血管结局研究(FOURIER)”的临床试验的发表,我们已经有了这种evolucumab,一种原蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/激酶9型抑制剂能够预防血管疾病临床重要事件的决定性证据。这种方法是降低低密度脂蛋白胆固醇方法的继续,超过了最大耐受度他汀疗法取得的效果,让患者受益更多。这种受益表现为到第一次出现心血管死亡、心梗、不稳定型心绞痛、中风或冠脉重建术的时间在统计上显著减少。试验最重要的一点是证明了LDL-C水平的持续下降已经低于我们常见的最具侵袭性的目标<70mg/dL,这让我们的综合终点显著下降了15%,第二终点也就是检测到更少的血管重建下降了20%。患者的受益更证明了使可能导致缺血性中风的梗死形成的急性事件下降了25%,使心梗事件减少了27%。这些变化发生在入院时存在明显血管疾病的患者身上。这些患者入院时的平均LDL-C的浓度为92ng/dL,入院时服用他汀类药物,平均随访期为2.2年。第二个重要的发现是使用evolucumab治疗的人群,LDL-C的水平能保持在平均30mg/dL的安全水平。不仅如此,连续用药患者这个效果可以保持2年以上且不改变其他降脂药物的剂量。但是,没有降低心血管死亡的记录。缺乏死亡率下降的记录,但是首次试验之后有明确的证据证明导致动脉硬化的急性临床事件的减少情况不明显,这仍是对他汀类药物的主要强烈批评之一。预防总体死亡尤其是预防心血管死亡的失败严重降低了其临床价值。幸运的是,北欧辛伐他汀存活研究显示心血管死亡率的显著下降在统计上显著降低总死亡率。许多降低胆固醇的药物的使用使得最初的反对日渐消失,他汀类药物的使用也开始快速增加。但是值得注意的一点是,北欧辛伐他汀存活研究的研究人群是患有冠心病且胆固醇水平较高的中年人群。通过试验将他汀(辛伐他汀)与安慰剂进行比较。许多研究指出后续使用他汀疗法的试验不能降低死亡率,作者仍在质疑如果不能预防死亡事件发生,他汀在医学实践中的真实价值是什么。作者希望得到傅里叶试验收效甚微的消息,因为心血管死亡率没有下降。证明心血管死亡率下降失败的原因很多且一些还非常明显。首先,试验设计经常选择死亡作为终点。在现代试验中,必须基于主要终点所有构成要素的估计发生率指定测量并计算研究人群的大小。达到预期数量时该试验随后通过积累终点来进行,这些终点都具有终止该试验的目标。当主要的临床终点已经通过或不通过显著的受益积累得当后,继续进行试验是不道德的。不能继续证明每个单一终点都会显著下降。在对照试验中,需要大量的事件证明统计强度。在试验人群中,特定原因的死亡和总死亡的频率低于直接导致心肌或脑部动脉闭塞的其他终点。大部分的患者会在其第一次出现组织梗死的实践中存活下来,但是只能将特定的、合格的事件计算在内。第二,长期试验方案应该排除受到血管疾病伤害的且处于死亡边缘的个体。试验中的心血管死亡率不能等同于全部患有血管疾病患者的死亡率。除非我们能记录直接由包含载脂蛋白B(apoB)脂蛋白的升高直接导致的发病死亡的人数,否则我们通过降低包含apoB的脂蛋白水平导致死亡率变化是不可信的。这使得将控制动脉硬化进展作为试验方法的试验终点变得很有问题。他汀和evolocumab通过降低包含apoB的脂蛋白,减少导致大型肌性动脉壁受损的主要生物力让患者受益。大部分急性事件很可能是因为这些受损位点内或表面的血栓导致。这些临床事件影响的是特定梗塞组织的功能。这就是我们看到临床试验人群中急性事件和与LDL-C相关非致命事件的减少的原因。但是,正如大部分他汀试验和傅里叶试验定义的那样,心血管死亡不会直接导致急性最终事件的动脉硬化。许多患者会因为多种不会导致动脉硬化的原因发生心血管死亡事件。恶性血栓栓塞导致的死亡算作心血管死亡,但在起源上说不是动脉硬化死亡事件。很多原因可能导致动脉瘤破裂,这些原因不是导致心血管死亡的原因。在心脏内,疾病的关键,电传导系统以及心肌层自身因为心律不齐和心衰导致死亡。这后二者与进行性肾病和陡降的估计肌酐清除率有关。由于我们的人群年龄都很老,后二者的问题变得非常普遍,可以视作常见的发病、住院和死亡的原因。有人已经注意到V期慢性肾病他汀降低血管疾病死亡率失败的原因可能是动脉硬化以外的原因。将心血管死亡作为终点但不能证明事件直接因动脉硬化而起弱化了期望LDL-C下降作为反应的综合终点。当然,任何长期临床试验都应该检查死亡和特定死因,因为存在重要的潜在毒性指标。任何药物在被建议作为长期使用之前必须确保其使用环境的安全性。但是寻求与特定疗法(与病程理论不相符的疗法)相关的结果只能对疗法干预受益性的解析造成不利影响。因为这个原因,人们可能希望在无需延长相对较短的研究时长的前提下,我们将在寻求进一步降低包含apoB的载脂蛋白能显著降低动脉硬化导致的血管事件的新的重要证据中获得安慰。《争议或共识—经皮冠脉介入治疗后心梗标准的演化》一文提到,经皮冠脉介入治疗后心梗(MI)的临床意义和定义一直是悬而未决的争议。由于使用了更加灵敏的诊断工具如心肌肌钙蛋白,证据日益增多,争论仍然继续,出现了手术MI(pMI)的定义。这个定义有多种版本,提出的定义也不尽相同,缺乏随机临床试验的标准化。本文将叙述经皮冠脉介入治疗环境中关键心肌标志物、肌酸激酶同功酶MB和cTn的关键临床数据以及导致pMI存在多种定义的问题。将侧重于现有“心肌梗死第三通用定义”以及心血管造影和干预协会提出的替代方法的基本原理。pMI的定义是一个正在演化中的领域,其中第三通用MI定义将最合理的证据与最科学的临床判断相结合融入定义标准,代表迄今为止最合理的定义,确保诊断的特异性和相关预后的显著性,同时尽可能地保持灵敏度。这个标准及其实际实施仍然存在问题,但是第三通用定义是向更加合理的标准迈进的里程碑,强化了pMI定义的一致性。本期刊登的《稳定型缺血性心脏病患者风险分层血液标志物》一文中说,多种循环标志物与心血管事件的发生有关,并被作为稳定型缺血性心脏病(IHD)的风险分层工具,但是目前的指南没有关于该疾病使用生物标志物进行风险分层的建议。本文将对用于稳定型IHD风险分层的生物标志物进行概述。与稳定型IHD患者的心血管风险有关的循环生物标志物反映了不同的病理生理学进程,包括心肌损伤、心肌应激和重构、代谢状态、血管炎症以及氧化应激。与一级预防环境相比,反映终末器官损伤、未来心衰发展风险和心血管死亡的生物标志物可能在稳定型IHD中发挥重要作用。因此,反映慢性、低水平心肌损伤和应激的生物标志物,即高敏心肌肌钙蛋白和利尿钠肽,与传统风险标志物相比,这两种生物标志物能提供对风险进行分级的更多的预后信息。与此相反,在稳定型IHD患者中,传统代谢生物标志物如血脂的预后价值非常有限。在新型生物标志物中,生长分化因子15能提供最稳定的预后信息,但是大部分炎症标志物能为包括传统风险因素、利尿钠肽和高敏肌钙蛋白的风险因素模型增加的预后信息非常有限。总体来说,循环生物标志物是稳定型IHD很有前景的风险分层工具,但将来它们能否与有价值的临床风险评分相结合将取决于严苛的前瞻性临床试验证明其是否可以强化风险预测。本期刊登的《2型心肌梗死和心肌损伤》一文指出,高敏心肌肌钙蛋白试验的发展和应用不仅加快了了急性心肌梗死(AMI)的排除和诊断,而且还可以通过高于99th百分位数的心肌肌钙蛋白浓度确认坏死的现象,鉴别存在心肌损伤风险的患者。存在坏死现象的心肌损伤可能在心肌梗死发生明显缺血现象时出现,或者因其他类型的心肌损伤没有明显缺血现象时出现。2型心梗(T2MI)已经引起了人们的注意;从概念上说,T2MI发生在出现明显心肌缺血的临床环境中,而不是因为急性动脉粥硬化成栓事件,动脉粥样硬化成栓事件是显著的心肌氧气供需失衡的原因。围绕T2MI及其与心肌损伤的关系出现了很多争议。本文对现有的T2MI概念及其与定义、诊断、管理、结局相关的挑战以及其与心肌损伤的关系进行了细致的研究,为临床医师和研究者的进步详述了一些关键的临床概念。临床实践中T2MI和心肌损伤非常常见,它们与较差的短期和长期结局密切相关。我们迫切需要快速的诊断策略对伴随或不伴随急性动脉粥样硬化成栓事件的缺血性心肌损伤和非缺血性原因导致的心肌损伤进行区分,我们还需要特定循证疗法改进T2MI患者的结局。《心肌梗死的早期排除和诊断策略》一文指出,进入急诊室诊治的患者大部分为胸痛患者,这些患者成为医疗卫生资源的主要负担。因此,十分必要安全而快速地鉴别患有和未患有急性心肌梗死(AMI)的患者。临床医师面临的挑战是准确地鉴别急性冠脉综合征患者,安全而快速地让未患有严重疾病的患者出院。本文利用侧重于利用最佳的肌钙蛋白结果总结了迄今为止最好的AMI排除和诊断策略的证据,罗列了基于敏感和高敏肌钙蛋白试验结果的证据,同时提及了利用新型生物标志物并讨论了快速诊断策略在将生物标志物与临床信息相结合的方法。利用侧重于肌钙蛋白算法和快速的诊断方案,大部分没有心梗或其他严重伤害风险的患者可以直接从急诊室安全地出院。需要利用这些策略对健康和经济状况产生影响的证据,因为该策略可以让患者和医疗卫生提供者受益。对胸痛患者和其他可能的急性冠脉综合征(ACS)患者进行评估对急诊室(ED)造成了巨大的负担,真正患病的患者人群仅占进入急诊室抢救的患者中暑的5%到10%。ACS,包括急性心肌梗死(AMI)和不稳定型心绞痛仍是大多数国家的患者死亡的原因,误诊显著与发病率和死亡率有关。临床医师面临的挑战是在30天内鉴别ACS患者或存在ACS风险的患者,同时安全而快速地让未患有ACS或不存在ACS风险的患者出院。及早对这些AMI患者进行快速鉴别就能及早地对这些患者进行基于证据的治疗,改善这些患者的结局,改进鉴别那些未患病患者的方法将让患者和卫生服务机构受益。可能患有ACS的患者的评估程序存在问题,鉴别患有AMI患者的传统方法耗时很长。与ACS相关的多种多样的症状让临床诊断的灵敏度受到挑战,因此开发一种结合心电图(ECG)和心肌坏死生物标志物的风险评分势在必行。仅仅基于临床症状判断患者存在ACS风险的效果非常有限,因此还用一些风险分层工具。这导致很多研究都在努力改进风险分层工具,进而找出最佳的排除和诊断规则。在过去的20年中,AMI生物标志物的证据逐渐形成。之前定期进行的生物标志物检验如肌酸激酶MB同功酶(CK-MB)、天冬氨酸转氨酶(AST)和乳酸脱氢酶试验都至少需要112小时。但是,现在由于具有更高灵敏度和特异性的心肌肌钙蛋白试验的发展,这种方法几乎已经弃用了。高敏肌钙蛋白试验能够准确地测量低于99th百分位数参考上限(URL)的肌钙蛋白浓度,与之前的试验相比,高敏肌钙蛋白试验改进了在该URL水平的精密度(变异系数低于10%)。随着高敏肌钙蛋白试验的出现,研究者们正在研究新的方法改进对AMI患者的早期鉴别。此外,研究者们还研究了更新的生物标志物如心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)和肽素的作用。正如我们正在研究快速排除和诊断ACS的方法,需要慎重考虑新策略可接受的失误率。医学上出现任何哪怕是极小的失误,都可能让我们不能保证鉴别患有或未患有ACS的患者。对临床医师而言,可以接受的不良事件错失率要低于1%,但是对患者而言略高一些的错失率可能是可以接受的。该领域的新型研究的诊断准确度(点估计和置信区间)结果需要慎重考虑,应该仔细审查不能确定策略安全性的小型研究的结果。本文仅利用肌钙蛋白策略总结了迄今为止最佳的AMI快速排出和诊断策略。提及了新型生物标志物的使用并讨论了快速诊断策略中结合新型标志物的方法。本期刊登的《系统回顾:脂蛋白相关磷脂酶A2及其与亚临床心血管疾病标志物之间的相互关系》一文提到,脂蛋白相关磷脂酶A2(LP-PLA2)是一种能显示促炎性质的酶并与亚临床心血管疾病有关。LP-PLA2与亚临床CVD之间的关系仍然不明。此次系统回顾的目的是明确这种关系。利用Ovid和PubMed对MEDLINE数据库中的文献进行广泛的研究。最初研究的444篇文献中,13篇符合选录和排除标准的文章被包含在本文中。在本文包含的13篇研究文献中,6篇检验了LP-PLA2与冠脉钙化(CAC)之间的关系,这6篇文章中的3篇显示前述二者之间存在显著的相关性。2项研究检验了LP-PLA2与内皮功能紊乱之间的关系,其中1篇报告了显著的相关性。5项研究探索了LP-PLA2与颈动脉内-中膜厚度(CIMT)之间的关系,其中3篇报告了显著的相关性。结论:此次回顾风险LP-PLA2和亚临床疾病之间存在多种多样的关系。该发现对未来的公共健康和临床实践有着管饭的意义。未来的研究需要明确LP-PLA2指导治疗的作用以及它是否与斑块的不稳定性有关,明确了这两点,LP-PLA2可以成为有用的风险预测标志物。


在《妇幼诊断》专刊中,刊登了《美国甲状腺病学会关于怀孕和产后期间甲状腺疾病诊断和管理指南2017》。怀孕期甲状腺疾病是一种临床常见病。由于美国甲状腺病学会(ATA)在2011年就出版了第一版关于此类疾病的管理指南,所以该领域的科学和临床研究已经取得了重大进步。这些指南的目的是让临床医师、患者、研究者和卫生政策制定者了解女性在怀孕、孕前和产后期间甲状腺疾病的诊断和管理的依据。基于先前版本的指南,该版本指南提出了特殊的临床问题。任务小组成员学会了利用综合方法学习知识,包括电子数据库检索、审查和相关引文的选择、选定研究的严格评价等。利用美国医师协会指导分级系统对关键证据进行严格评价,并对建议的等级强度进行分级。指南任务小组完成了独立编辑。指南任务小组成员定期更新、管理该指南并与ATA和任务小组其他成员沟通。修订的怀孕期间甲状腺病管理指南包括怀孕期间甲状腺功能试验解析的建议、碘营养、甲状腺自身抗体和孕期适应症、不孕女性值得考虑的甲状腺事项、孕期甲状腺功能减退、孕期甲状腺功能亢进、甲状腺结节、癌症、胎儿和新生儿注意事项、哺乳期甲状腺疾病、孕期甲状腺功能紊乱筛查和未来研究的导向。指南发展的循证建议让孕期和产后女性的甲状腺疾病管理的临床决策制定更加科学。指南认为必须提供个体化的建议才能达到甲状腺疾病患者护理最优化的目的。


在《微生物与感染》专刊中,刊登的《用于血流感染诊断的浓缩细菌DNA》一文指出,血液培养是用于鉴别败血症细菌性病原体的常见方法。诊断败血症的PCR试验需要从血液样品中提取细菌DNA,因此延误了进行合理抗生素治疗的时机。存在的多种人体DNA可能会严重降低PCR检测细菌的灵敏度。通过连续稀释加入到假败血症血液样品中的大肠杆菌,开发了一种结合了极性清洁溶剂和基础pH调整的简单方法来去除人体DNA。建立一种基于基因的16S rRNA筛查算法来区分细菌菌群以及肠菌科的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌,并对结果进行严格确认和合理控制。这种人体DNA去除方法随后通过实时PCR应用于194份败血症血样和44脑脊髓液(CSF)样品。这个简单而直接的方法可以去除败血症患者外周血中98%的人体DNA。人体DNA的抑制效果非常明显,实时PCR的检测限可以提高到10大肠杆菌CFU/ml。灵敏度是传统的实时PCR试验的10倍以上。传统血液培养可以检测58/194(30%)的败血症和9/44(21%)的CSF样品。在检测的194份样品中,传统的实时PCR仅能检测13种导致败血症的常见病原体细菌DNA,概率为16/194(8%)的血样以及14/44(32%)的脑脊髓液样品。我们的新方法能准确诊断78/194(40%)的血样和14(32%)份CSF样品。结合血液培养后,我们的技术能将败血症的诊断率提高到58%(112/194)。在检测的阳性组中,46份(24%)的病例与传统方法吻合。本文报告的能从败血症血样中去除人体DNA的简单高效的室内方法是一种制备后续PCR试验所用DNA的分析前工具。这种室内DNA去除方法能提高检测率,后续PCR试验能达到10大肠杆菌CFU/ml的检测限,显著提高败血症的诊断率。本期刊登的《关于直接对血流感染进行分子检测的临床观点的前瞻性多中心评估》一文指出,快速的诊断和合理的抗菌疗法对降低血流感染(BSI)患者的发病率和死亡率具有重要价值。目前,血液培养这一检测血液内细菌的金标方法,至少需要24—48小时才能得出结果,如果在采样期间患者正在接受抗生素治疗,那么该方法的灵敏度将会非常有限。此次前瞻性多中心研究的目的是对直接基于全血的一般商购16S/18S rDNA PCR,SepsiTest™ (PCR-ST)的应用进行临床评估。此次研究包括来自166名疑似患有败血症患者的236份样品。将取得的PCR-ST结果与血液培养(目前检测BSI的金标方法)结果进行比较。由于血液培养会得出假阴性结果,所以我们利用基于临床诊断的评估、其他诊断试验和实验室参数执行额外分析来解析血流感染的可能性。对结果的临床解析在22/43个阳性血液培养结果(51.2%)和21/47个阳性PCR-ST结果内(44.7%)排除检测到的污染生物体。排除这些生物体后,PCR-ST的总体灵敏度和特异性分别为66.7%和94.4%。在36份相关临床样品中,2种技术同时检测出的BSI样品为11份;单独使用PCR-ST方法检测出15份BSI样品;单独使用血液培养方法仅检测出10份BSI样品。因此,此次研究中与单独使用血液培养方法相比SepsiTest™ 额外检测出71%的BSI样品。通过分子方法可以检测出更具有临床相关性的BSI,这样一来可能会影响患者的治疗。改进的SepsiTest™ 试验适于日常使用,对败血症患者菌血症的诊断具有额外价值。本期刊登的《SEPSIS-3时代单核细胞趋化蛋白1和白介素6预后价值再评估》一文指出,败血症标志物评估的研究不能体现单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和最新的SEPSIS-3标准。因此,此次研究根据SEPSIS-3标准比较了MCP-1和白介素6(IL-6)对败血症和败血性休克患者的预后价值。方法:136名患有败血症和败血性休克的患者全天24小时进驻ICU。并在进驻后的第一天、第三天和第八天测量这些患者的MCP-1、IL-6、降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)和白细胞(WBC)。跟踪这些患者的30天和6个月全因死亡率。与PCT、CRP、SOFA和APACHE II评分相比,在第一天和第三天MCP-1和IL-6水平都显示对30天和6个月全因死亡率有可观的预后价值(MCP-1的AUC范围0.62-0.65,p<0.039;IL-6的AUC范围0.65-0.70,p<0.021)。与存在低水平MCP-1的患者(风险比(HR)范围=2.1-3.3,p<0.041)相比,处于4th四分位数的MCP-1显示出最高的30天和6个月死亡率。MCP-1的预后价值在多变量回归模型中仍然显著并可与IL-6相比。最后得出结论根据最新SEPSIS-3的定义,MCP-1和IL-6都对败血症和败血性休克患者的短期和中期全因死亡率具有预后价值。


在《精准医疗》专刊中,《结直肠癌筛查的应用及其意义》一文指出,在美国CRC的发病率和死亡率的大幅度下降,很大程度可归功于筛查预防和早期检测。建议进行的CRC筛查试验分为2类:1)主要检测癌症的试验,包括粪便潜血试验(gFOBT)和免疫化学粪便潜血试验(FIT)以及脱落DNA(sDNA)的粪便试验;2)能检测癌症和晚期病变的试验,包括内窥镜和反射检查,即弹性乙状结肠镜检查、结肠镜检查、双对比钡剂灌肠检查和CT结肠镜检查(或虚拟结肠镜检查)。这二者的区别有助于初级护理医师了解决策制定并理解这些筛查试验的特点、优势、缺点/局限性。与此同时,还建议对较高CRC风险的个体进行加强监测,这意味着如有可能建议进行结肠镜检查,这包括更加频繁和更早的检查。在这里所涉及的CRC高风险个体,主要指的是:1)存在腺瘤性息肉病史的个体;2)存在CRC有效切除史的个体;3)存在CRC家族史或一级亲属诊断为结直肠腺瘤的个体,基于亲属的诊断年龄采取不同的建议;4)由于炎症性肠病显著发作期间出现高风险的个体;5)由于已知或疑似存在遗传疾病如林奇综合征(遗传肠癌)或家族性腺瘤性息肉病,存在高风险的个体。文章指出,随着科学技术的不断进步,游离细胞DNA(cell free DNA)正在成为一类新的肿瘤检测与诊断的生物标志物。接着介绍了cfDNA和ctDNA的特点。对于ctDNA分析的方法,本文指出ctDNA的分析范围很广,从单一突变到全基因组分析都有涉及。个体突变分析采用设计合理的试验能以简单的流程达到高灵敏度。Mid-2000s用于血清和血浆热点突变检测后就开始使用等位基因特异性PCR方法了。一些试验以试剂盒的形式获批进行临床应用,但是分析灵敏度有限。微流体平台的DPCR试验是高灵敏度定量试验,广泛用于ctDNA水平定量。在选定的基因座改进检测已经被单碱基延伸法、电泳突变等位基因富集方法、核酸酶活性或改进的PCR证明。这些试验具有多重能力,依靠突变和野生型等位基因的特异亲和力。但大部分试验需要针对突变或靶定的基因座的特殊引物或探针,性能有限。因此这些试验通常适用于研究少量突变和热点癌症突变的分析。如果样品需要多个反应,就会增加采样误差,对于拷贝数非常低的突变DNA,试验的总体性能会大幅下降。为了研究较大数量的基因座,可以利用PCR扩增或杂交捕获技术的靶向测序。测序区域可能为单个外显子(千碱基)到整个基因组(~50Mb)。现有基因测序试验能采用大于1%的等位基因片段检测突变。通过降低测序的背景错误率—例如通过分子条码,或运行多个副本—可以在低于0.1%的等位基因片段检测ctDNA。基于扩增子的试验已经被优化用于ctDNA分析,这类试验可以在数千个碱基中标定几十到上千个扩增子,同时具有高灵敏度。杂交捕获方法可以将研究的基因组区域增加到几十到上千个碱基。即使输入材料有限,但通过使用多个患者特异性试验结合靶向测序的方法,可以进一步提高ctDNA检测的灵敏度。通过对全基因组的低深度(~0.1X覆盖范围)测序,可以鉴别扩增和缺失,样品间或样品和对照组间相同大小基因组区域测序读数的相对数量可以进行后续比较。这样的影子WGS(sWGS)已经用于检测胎儿异倍性,还可以用于检测特殊癌症拷贝数变化。SWGS的突变等位基因片段检测限为5%至10%,所以在检测较早阶段的疾病时灵敏度有限。如果需要对少量循环拷贝数变化进行分子检测,就需要通过单核苷酸多态性靶向测序实现较高的灵敏度,使检测的拷贝数变化低至0.5%。试验的检测限会因个体疾病状态和肿瘤突变的特征发生变化。通常会通过先前患者肿瘤样品中鉴别的定量突变(或其他变化)评估血浆肿瘤负担。对于需要多个基因或热点试验检测的突变,假阳性的风险会随着多重假设试验的试验规模的增加而增加,还需要过滤器增加特异性;但是使用过滤器会降低罕见变异体的灵敏度。之前关于突变的认知(例如通过肿瘤测序数据)能检测背景错误率之上的特殊患者突变。因此,除用于突变特点描述外,基于测序的试验是ctDNA测量和监测的灵敏定量工具。使用多种方法可以定量ctDNA,如突变等位基因浓度(每毫升拷贝数),或突变等位基因片段。每种方法都受到分析、分析前和生理特征的不同影响。例如,ctDNA周转率的代谢变化对突变等位基因的影响大,但是对突变等位基因片段的影响小,且影响血细胞内种系DNA释放的分析前因素会以较大的幅度减少突变等位基因片段。ctDNA的分析(片段和浓度)以及总cfDNA和ctDNA片段的分析能提供补充信息,在以不同的方式使用或联合使用时具有一定的优势。概念验证研究是ctDNA临床应用大型前瞻性研究的良好起点,证明ctDNA可能是药物研发、瘤内多样性和克隆演化的有用研究工具。未来比较ctDNA指导决策和护理标准的随机试验将是决定性的,EMA已经为这样的试验试剂提供了良好的实践指南。检验ctDNA分析用于临床治疗监测的试验正在进行。在一项试验中,接受埃罗替尼治疗的NSCLC患者正在接受前瞻性监测,如果血浆内出现耐药突变,则将进行额外检测研究疾病进展的信号。另一项旨在证明晚期乳腺癌患者血浆内鉴别出的靶向突变的效果,该研究的发现将仅支持未来血浆突变图谱的应用和治疗分层。总之,这些研究强调该领域正在从ctDNA的探索阶段向ctDNA指导决策制定的临床试验阶段发展。加深对cfDNA和ctDNA的理解将有助于实施液体活检。应该研究治疗的不同时间点,细胞凋亡、坏死核活性释放对这二者的作用。我们对cfDNA释放和清除机制的有限理解阻碍了目前研究的解析。在不进行解析的情况下,进行ctDNA测量再现和动态研究将变得非常重要,因此我们试图解析治疗反应的ctDNA信号。所有肿瘤亚克隆与总ctDNA是否成比例或它们在血流内的表现是否基于其他生物因素如肿瘤血管或代谢活动目前尚不明了。体外细胞条码试验和尸检能说明个体亚克隆的作用,组织学研究可能能够明确调节ctDNA释放的因素。ctDNA和cfDNA片段的大小不同说明在回收特定大小的片段时,优化处理和提取方法可能能够改进整体性能。尽管ctDNA分析与其他循环生物标志物分析相比灵敏度和特异性较高,但是采用多标志物方法能对患者疾病状况有更加全面的了解。例如,总cfDNA浓度与疾病状态和预后有关。cfDNA的表观遗传学分析能鉴别癌症基因的超甲基化或使cfDNA片段水平升高的细胞类型,可能能够提供关于肿瘤微环境的信息,锁定体细胞突变。其他循环核酸如mRNA和微小RNA能提供额外层面的信息。靶定具有独立释放机制的多种核酸类型(例如通过隔离核外RNA和cfDNA)可能能够提高MRD的检测灵敏度。活跃释放的核酸可能是检测对疗法具有耐受性亚克隆内突变的优先选择,但是疗法开始后死亡的细胞的片段可能能够鉴别对治疗有反应的亚克隆。尽管可能从cfDNA一段基因表达方式,外来体、CTC或血小板内的测序RNA能提供更加直接的证据。血浆和其他体液如尿液或脑脊液内的cfDNA分析能提供补充信息。作者进一步强调Gormally等人十年前的建议:与cfDNA有关的蛋白的特征是患者疾病和cfDNA生物学丰富的信息来源。临床采用液体活检取决于患者和医师的实践优势、所需基础设施和经济状况。组织活检将在癌症管理中继续发挥关键作用,尤其是组织学诊断和癌症分类。目前,专业的实验室已经开始处理CTC和ctDNA样品,未来在条件允许的情况下,医院实验室可能也能够执行本地分析。具有个体热点突变鉴别临床级别灵敏度的床旁护理设备开始用于组织和血浆样品。2015年首次证明了孕妇血浆DNA单分子(第三代)测序的可行性,随后证明可以检测细胞系DNA结构性变异。埃博拉病毒肆虐期间这些设备的灵活性证明它们可以进行实时基因组监测。目前这些平台的缺点是错误率高,使得单核苷酸变异和插入缺失的检测存在挑战。其他的挑战还包括短DNA片段测序,这需要最优化的文库制备方法。测序能力也受到限制(目前为~150Mb)。通过实时选择性测序可以靶定特殊扩增子。这些研究支持床旁分子检测,尤其是不需要费时费力的DNA纯化步骤时,可以对血浆进行分析。最初EMA和FDA批准该方法用作血浆内突变检测的伴随诊断,新出现的ctDNA临床试验是液体活检在个体化肿瘤学实际应用中的里程碑。随着技术的改进,癌症的无创分子分析的使用范围会越来越广,提供的信息有助于开启新的基因组研究之门,并有助于临床决策。为了完全发挥液体活检的潜在能力,进一步探究ctDNA的生物学非常关键。因此液体活检尚有大规模应用的潜力,且已经开始让患者获益。文章最后总结道,随着在CRC患者血清中更多的miRNA被检测与分析,相信会有更多的miRNA可作为CRC的检测与筛查标志物,并随着其临床研究的不断深入,其作为商业化产品的成功开发也指日可待。本期刊登的《循环肿瘤细胞浓缩后的简要工作流程:从系统计数到突变分析》一文介绍了一项目的在于建立一种具有高度适应性的微流体工作流程促进系统性CTC计算和遗传研究的工作。方法:为了促进CTC的计算,利用一种开源图像分析仪将CK/EPCAM免疫染色策略和自动化CTC分析流水线相结合。利用这种工作流程的优势,用一种高通量螺旋微流体芯片系统进行了一项包括56名癌症患者和21个健康个体的试点研究。为了促进CTC体细胞突变的研究,将CTC计算和下一代测序结合,建立了一个包括多元化随机序列和经过测序的CTC样品的简单扩增子文库。经过ROC分析,CTC染色和计算工作流程达到了80.4%的灵敏度和85.7%的特异性(AUC=0.87,P=0.004,power=0.985)。单变量和多变量分析证明CTC(CK/EPCAM+CD45-),但没有验证其他细胞群,验证工作证明其是癌症患者的重要而独立的生物标志物(P<0.01)。癌症患者的连续CTC监测揭示治疗后CTC数量减少,药效学研究表明其具有临床实用性。CTC样品的深度测序揭示TP53和ESR1存在体细胞突变。本报告的意义是证明一个系统性的和具有适应性的工作流程能消除微流体浓缩和CTC分析之间的鸿沟,使得CTC在临床和理论研究中得到更加广泛的应用。


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