六种肝炎血清学 标志物回顾

发布时间:2017-10-02       作者:Arch Virol       来源:临床实验室        浏览:17629       收藏: 0

摘  要


病毒性肝炎是一种由下列6种肝炎病毒之一引起的肝脏感染,这6种病毒是:甲、乙、丙、丁、戊、庚型病毒(HAV到HEV和HGV)。这些病原体的生物学、免疫学、病理学和流行病学特征各有不同。这些病毒引起感染时会表现出症状,导致临床特征的出现,实验室检验的结果表明,某些病毒引起的临床特征并不具有特异性,因此使得鉴别诊断相当困难,尤其是在患者病史或流行病学背景不明的情况下。一些急性期血清学标志物如抗HAV、抗HBc、抗HDV和抗HEV IGM可以对HAV、HBV、HDV或HEV引起的感染进行明确的指示,抗HCV抗体和HGV/RNA用于诊断HCV和HGV感染。我们回顾了每种标志物的重要性,记录了能对这些病毒引起的急性感染的诊断存在干扰的不同因素。


简  介


病毒性肝炎是全球主要的公共卫生问题之一。是由下列病毒中的一种或多种引起的肝脏感染,这些病毒包括甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)和戊型肝炎病毒(HEV)。此外,庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV)在宿主体内存在的水平很低或检测水平很低,但是由于其在循环淋巴细胞中更容易检出,因此通常被认为它的亲淋巴性强于亲肝性。


这些病原体的生物学、免疫学、病理学和流行病学的特征各不相同。出现有症状的感染时,这些病毒会引起发热、不适、疲劳、恶心、呕吐、厌食、黄疸和右上腹部不适。这些临床特征都不足以有针对性地鉴别是哪种病毒引起了疾病。此外这些病毒感染通常和血清胆红素水平高、凝血酶时间延长和血清转氨酶水平及血清白蛋白水平升高有关,但是这些检测结果可能仍然不足以进行明确的鉴别诊断。在这种情况下,患者的临床病史和流行病学背景,包括年龄、出生地、是否被尖锐物体刺伤、输血史,以及社会、文化和行为特征等都是重要的疾病病因学诊断依据。但是在大多数情况下,这些信息不完整,有时甚至不准确,因此这些信息对病例研究的帮助微乎其微。


考虑到临床、检验和流行病学的局限性,大多数情况下,依靠使用适当试剂的特异性血清学试验或基因组扩增试验来实现可靠的诊断非常必要。因此在研究疑似急性病毒性肝炎感染病例时,使用具有高特异性的血清学标志物非常重要。本文回顾了这些标志物以及对准确诊断造成特定干扰的因素。


甲型肝炎病毒(HAV)


抗HAV IgM抗体

甲型肝炎病毒(微小核糖核酸病毒科肝病毒属,HAV)是人体急性肝炎发病的病因,还是因接触受污染的食物或饮水以及密切身体接触导致大规模疾病爆发的原因之一。尽管HAV在全球分布很广,但是仅在医疗卫生条件很差的地区才会出现。20%—25%的临床肝炎病例由HAV引起,该病毒主要通过粪口途径传播。但是通过吸毒和性接触这两种非肠道途径也可传播。甲型肝炎是儿童人群的主要疾病之一。


抗HAV IgM抗体是传统的甲型肝炎病毒急性感染的血清学标志物,检测这些抗体是疑似急性肝炎病毒感染病例研究方案的一部分,尤其是儿童,因为未接种疫苗的儿童人群的甲型肝炎发病率较高。但是成人抗HAV IgM的检测同样不可忽视,尤其是农村地区的成人人群或来自人口密度高或医疗卫生条件较差地区的成人人群,因为社会经济指标与甲型肝炎的地方性密切相关。甲型肝炎集中爆发的区域已经减少,但是重要的是该疾病的传播模式已经发生了变化,从儿童无症状感染向成人有症状疾病发病率升高转变。甲型肝炎流行病学的变化和感染的临床特征强调了研究成人人群标志物的重要性(还因为甲型肝炎有症状病例的百分比大约75%,似乎大于感染其他肝炎病毒后有症状病例的百分比),尤其是在有流行病史支持的情况下。


疑似病例定义为突然发生下列症状:发热、头痛、恶心、极端虚弱、厌食、呕吐、腹泻、小便黄赤、粘土样便以及黄疸。实验室确认病例定义为任何疑似病例的抗HAV IgM试验结果呈阳性。甲型肝炎病毒感染后有14—45天的潜伏期,出现症状时检验结果通常为阳性,疾病出现后的大约3—6个月内,检测结果仍为阳性。但是有报告指出在症状出现前的几天内就可以检出抗HAV IgM,而且少数个体在感染后抗体会持续存在至少30天。此外,有报告称一些个体在至少5年内抗HAV IgM检测结果仍会呈阳性。检测结果持续呈阳性的可能原因包括先前感染过HAV的个体体内存在低水平但与临床无关的循环抗HAV IgM以及与其他血清因子或药物的交叉反应。另一方面,在出现临床表现时,抗HAV IgM检测偶尔会呈阴性,如有怀疑,则很有必要在检测后的1—2周内重复检测进行HAV感染确认诊断。关于这种观测结果的一种可能的解释是为了防止假阴性结果而进行的试验前血清稀释能导致低定量血清丧失反应性。


在抗HAV IgM表达和检测之前,急性甲型肝炎病毒感染病例可以通过检测HAV RNA进行诊断。这种分子标志物在急性血清学标志物出现前大约14天就可以检出,而且在症状出现和肝酶达到峰值后的平均79天内还可以检测到。对于其他感染而言,基因组扩增是一种绝佳的工具,不仅可以诊断急性感染,还能监测病毒血症的时间。但是,考虑到急性病例诊断一般不用基因组扩增技术(因为费用高不太划算),IgM抗体试验似乎是最实际的选择。


抗HAV IgM试验的诊断灵敏度和特异性都很高,超过了99%。目前,标准化的试验采用类似的IgM抗体捕捉系统,但是由酶链化学发光或其他非放射方法完成抗体检测。无论使用哪种方法,样品稀释是有症状患者和急性肝炎感染患者诊断的关键。稀释结果偶尔会导致阴性检测结果(显然因为循环抗体的稀释问题),结果在数天或数周之后会变为阳性,并据此做出决定性诊断。


检测此类标志物的标准化试验已经证明具有一致的结果和良好的分析性能。我们对Bio-Rad Laboratories开发的抗HAV酶免疫分析法(Monolisa anti-HAV IgM EIA)进行了评估,并将结果与使用经过FDA批准的DiaSorin S.p.A ETI-AB-HAV-IgMK Plus方法取得的结果进行了比较。Bio-Rad试验检测IgM抗体的相对灵敏度和特异性分别为100%和99.44%。该试验的性能可以与参考试验相比,这证明实验室可以有效地利用该试验诊断急性感染。


第二项研究比较了下列三种抗HAV IgM免疫试验的性能,这三种试验是Architect HAV 抗体(HAVAb)-IgM(雅培),Elecsys 抗HAV IgM(罗氏诊断)和ADVIA Centaur HAV IgM(西门子)。该研究证明Architect和ADVIA Centaur、Architect和Elecsys以及ADVIA Centaur和Elecsys之间的一致百分比(kappa)值分别为96.6%(0.91)、96.6%(0.92)和97.8%(0.94)。在上述研究中,9%的检测样品出现了有差异的结果,这是由于大部分病例的S/CO值在灰色区域内。最近抗HAV IgM化学发光免疫分析法得到了广泛应用,因为与酶免疫分析法相比,这种方法显著提高了特异性并降低了技术难度。


尽管甲型肝炎病毒IgM抗体的存在是急性甲型肝炎诊断的黄金标准且这类试验的特异性很高,但是可能会发生未患有急性甲型肝炎的患者检出甲型肝炎病毒IgM抗体的事件,由此出现的假阳性结果导致错误的实验室诊断。


无典型肝炎症状的老年个体的样品检测中已经出现了这种现象。患有肝脏疾病的有症状患者或由于其他疾病导致炎症的有症状患者容易出现这种现象,如不明原因肝硬化导致的肝脏衰竭、慢性肝炎或肝癌,但是没有典型急性病毒性肝炎的症状。其他可能导致假阳性结果的原因与样品内存在类风湿因子有关,通过桥接捕获抗体和信号抗体以及与其他试验内抗原表位或病毒性肝炎抗体交叉反应干扰了抗HAV IgM检测。这种假阳性现象可能也和免疫机制有关。众所周知免疫细胞在病毒感染或免疫疾病发生时活化。因此先前无关病原体感染的记忆细胞的非特异性多克隆活化作用导致可以检出特异病毒抗原的IgM抗体。最后,抗HAV IgM抗体的假阳性可能与甲型肝炎疫苗有关,8%—20%的甲型肝炎疫苗接种者在接种后2—3周内能检出抗HAV IgM,一些病例甚至在接种后1个月还能检出抗HAV IgM。这些结果表明多种因素可以导致甲型肝炎IgM抗体试验出现非特异性阳性结果。


考虑到抗HAV IgM在急性感染诊断中的杰出性能,此类试验应该仅用于患有在临床上与急性HAV感染不冲突的疾病的患者或存在流行病学适应症时。不考虑这些标准而使用抗HAV IgM试验可能导致患有无关甲型肝炎疾病的个体出现抗HAV IgM阳性的检测结果。另一方面,一些甲型肝炎病例没有症状,这说明在没有临床症状或生物学异常时也可以检出抗HAV IgM抗体。此外,应该注意的是急性甲型肝炎可以在不产生可检测的IgM抗体的情况下发生。


乙型肝炎病毒(HBV)


抗HBc IgM抗体

乙型肝炎病毒是一种包膜DNA病毒,属于肝脱氧核糖核酸病毒科。乙型肝炎在全球的分布也很广,但是在一些区域如亚马孙河流域、撒哈拉以南的非洲以及亚洲的部分地区感染率、发病率、流行率都很高。乙型肝炎病毒主要通过接触被感染的体液传播。尽管其他体液也能传播病毒,包括精液和唾液,但血液是最重要的传播媒介。因此,HBV可以通过经皮或粘膜暴露于被感染的体液、与被感染者的性接触或围产期母婴垂直传播。由于HBV DNA可能整合到生殖细胞基因(人体精子染色体),父亲和婴儿也可能发生垂直传播或后代受精期间感染。


在抗HBc IgM抗体表达之前,在感染后的20-30天内可以在血流中检出HBV基因组,在感染后的大约59天内可以检出HBsAg,这取决于试验的灵敏度。这些标志物的早期表达,尤其是HBV DNA,表明检测这类标志物是最近感染早期诊断的最佳策略。该策略与献血者筛查还有很大的相关性,因为它能让HBV通过血液传播的风险降低到最低限度(在献血质量控制中具有主要优势)。它与临床环境中患者的相关性较小,因为即使确认为最近发生感染,也没有可以采用的有效临床方法。不仅如此,实验室使用分子试验进行最近感染的诊断过于昂贵。因此,在临床环境中检测抗HBc IgM抗体是研究疑似急性HBV感染的出发点。该标志物呈阳性表示存在HBV感染,或者更准确地说是处于急性感染阶段。另一方面,阴性结果排除最近暴露急性感染的可能性。但是,普遍的共识认为实验室检测HBV感染的判定方法应该采用HBsAg,并随后检测抗HBc IgM抗体。


即使在潜伏阶段,也得大约在HBV感染6周后,血流中才能检出抗HBc IgM抗体,大约在HBsAg出现一个月后。这些抗体在感染后2到6个月内仍可以检测到,尽管有报告称它们可以在血液循环系统中存在2年以上。


感染后或慢性病毒感染患者体内的再活化发作期间,HBV核心抗原与B细胞的相互作用立即直接产生抗HBc IgM。存在于血流中的HBV核心抗原(由最近感染或慢性感染肝细胞裂解物生成)能通过T细胞依赖性或T细胞非依赖性机制诱导抗体生成。HBV核心抗原与B淋巴细胞(T细胞非依赖性)直接发生相互作用较好地诱导IgM同型抗体产生,然而其余B淋巴细胞的相互作用,通过T淋巴细胞(T细胞依赖性)诱导IgG同型抗体(还有IgM类)的生成。这些特征使得抗原在急性感染阶段成为显著的免疫反应诱导物,接触HBV的个体这种反应将维持终生(通过IgG同型)。


检测抗HBc IgM抗体可能不足以诊断急性感染,因为这些抗体的表达与慢性感染的急性再活化同时存在。由于抗HBc IgM的检测表明是最近暴露或慢性HBV感染急性再活化导致的急性HBV感染,因此这种标志物的阳性结果意味着实验室需要进一步研究鉴别这两种不同的临床条件。建议使用下列方法:(1)抗HBc IgM抗体水平定量评估;(2)在血流中检测其他与HBV相关的血清学标志物;(3)检测的标志物的动力学评估;(4)依照显示的评分结果,对检测的病毒标志物与血清学结果进行综合分析。近期暴露出现急性感染的病例,在恢复期之前和免疫恢复标志物出现之前应该进行血清学检测(抗HBe和抗HBs抗体)。此外,患者调查的流行病学背景和临床病史有助于在急性感染还是慢性感染急性加重之间进行鉴别诊断。这包括可能的暴露信息(如近期输血、注射或与感染个体有过性接触),表明其是急性感染;或研究慢性感染病史(慢性乙型肝炎病毒感染家族史、先前的输血史或先前的HBsAg阳性状态),表明可能的慢性感染再活化。


应该强调的是在慢性感染再活化的情况下生成的抗HBc IgM水平往往低于近期暴露后急性感染期间生成的抗HBc IgM水平。这得益于检测的分析灵敏度低至7 PEI单位,这是目前试验的一个特点。使用比较老旧的IgM试验不能观测到相同的结果,因为这些试验的分析灵敏度为600—700 PEI单位。


目前有一些标准的抗HBc IgM抗体检测和定量试验。最常用的试验包括酶联免疫吸附试验(Diasorin-Sallugia的ETI-CORE-IGMK PLUS 抗HBc IgM)、抗HBc IgM(Bio-Rad的Monolisa HBc IgM)以及化学发光免疫分析法如ADVIA Centaur 抗HBc IgM试验(Bayer diagnostics),以及Immulite 2000抗HBc IgM试验(Diagnostic Products Corporation)和ARCHITECT抗HBc IgM试验(雅培)等等。尽管与化学发光法相比,免疫酶法的特异性较差,但是大部分试验性能良好,结果变异性低,急性阶段诊断的灵敏度高,不易受样品中类风湿因子的影响。一些比较了不同化学发光试验的研究证明获得结果的一致性高达100%,检测特异抗体的特异性达到100%。


尽管抗HBc IgM是HBV感染急性阶段仅有的血清学标志物,但是临床医师要求在日常HBV感染疑似病例中开展HBsAg检测。该方法可能不是十分必要,但却具有决定性。因为该标志物可在早期阶段检出,即使在潜伏期也可检出,在抗HBc IgM抗体出现后还可以检出。因此,由于其独特的动力学,它通常会在感染的有症状阶段伴随这些抗体出现,有助于急性病例的确定。应该注意的是,尽管HBsAg是转录活性标志物(潜伏期间、慢性感染急性再活化期间或无症状携带者中观测到的现象),但它不是一种精准的进行阶段标志物。不仅如此,很有必要说明的一点是急性病例的HBsAg检测不是普遍结果或基本原则(不能因为缺乏HBsAg检测排除急性感染),因为大约20%的急性病例不能检出HBsAg。


不能检出HBsAg的现象与病毒早期清除有关,通常是HBV复制抑制的结果。这一现象的机制尚不清楚。但是,已经了解的是该现象依靠病毒的决定因素(如基因型和突变)还取决于宿主的免疫反应,包括CD4(+)细胞反应的CD8(+)T细胞感应(HBV适应性免疫反应的主调节器)。试验的灵敏度问题也让急性感染阶段的HBsAg检测效果大打折扣。罕见但重要的一点是,筛查试验不能检出的HBV/HBsAg突变体引起的急性感染也可能导致不能检出HBsAg。在这种情况下,可以通过单独检测IgM抗体确定感染的急性特性。这意味着近期感染后存在抗HBc IgM抗体时的HBsAg检测结果表明急性感染情况下的高转录活性(持续复制)。


总之,考虑到疑似急性HBV感染病例频繁地需要HBsAg检测的现实,在缺乏抗HBc IgM抗体时的HBsAg检测不能支持急性感染诊断。在这种情况下,有必要进行后续评估做出决定性诊断或说明该标志物独立反应性的可能原因。


丙型肝炎病毒(HCV)


抗HCV抗体

丙型肝炎病毒(HCV)是黄病毒科的一员,是一种包膜病毒。HCV能有效通过被感染的血液经皮暴露传播。因此,使用受到污染的针头注射毒品是HCV最常见的传播方式。HCV的其他传播途径包括职业暴露、围产期传播(分娩期/子宫内)、医护步骤操作不当暴露等,性接触也是可能的传播途径之一,但不常见。世界范围内HCV的流行率因地理区域的不同而存在差异;发病率较高的地区(超过3.5%)包括蒙古、中国在内的亚洲东部地区;包括巴基斯坦和泰国在内的南亚、东南亚地区;包括埃及在内的北非地区;发病率较低的地区(低于1.5%)包括一些亚洲国家如韩国和日本以及包括美国在内的北美地区,南美洲的发病率也较低。HCV感染通常是没有症状的(85%-90%的病例),成人人群(30—50岁个体)的发病率较高。大约80%的HCV感染患者发展为慢性肝炎。


现有的HCV感染诊断方法有使用血清样品的抗HCV抗体检测以及HCV RNA检测。这些检测能够区分既往感染、被清除的HCV感染(抗HCV [+] / HCV-RNA [-])和当前感染(抗HCV [+] / HCV-RNA [+]),但是不能区分急性或慢性感染以及慢性感染急性发作。因此,抗HCV抗体是实验室HCV疑似感染病例(有症状)研究唯一的血清学标志物选择(因为它是目前唯一的标准化的方法)。尽管急性HCV感染个体体内的IgM同型抗体是一种自然免疫现象,但是基于IgM抗体检测的急性HCV感染血清学诊断方法难以进行。这和目前缺少特异性检测抗HCV IgM抗体的标准化实验有关。与其他病毒感染急性阶段抗体的标准化检测试验形成对比,基于IgM抗体的试验不能专一地辨别抗HCV IgM,因此不具有特异性。


在HCV慢性感染的患者体内也能轻易地检出抗HCV IgM抗体证明了这种方法的技术局限性,尽管有报告称急性感染患者检出的HCV IgM抗体水平比慢性感染患者的水平高。此外,急性感染的IgM抗体的水平可能显著不同,但是慢性HCV感染患者体内也有很高的概率检出该抗体。最后,即使在已经证明是急性HCV感染的情况下,报告的HCV特异IgG和IgM水平也非常接近。因此区分IgG和IgM同型抗体基本上无助于区分急性和慢性感染。


目前广泛采用的血清学试验是第三代标准化的抗HCV抗体检测试验,该试验仅能进行检测,但不能进行同种型测定。在进行检测时,绝大部分(但非全部)检测采用单克隆抗人IgG抗体(结合),该方法仅能检测IgG同型抗体。这些试验采用多种抗原的形式,包括核心抗原(结构蛋白)和非结构蛋白的NS3、NS4和NS5的免疫显性表位。最近,结合了额外非结构蛋白的第四代抗HCV试验已经开始作为筛查试验使用,该试验的目标是不同的HCV抗原,该试验能够检测5种以上的抗体,确保了该试验的灵敏度和特异性。这些试验可以在暴露后的第十周或更早的时间内检测特异性抗体,但取决于采用的技术。


采用不同技术(酶联免疫分析法[ELISA]、化学发光免疫分析法[CLIA]和电化学发光免疫分析法 [ECLIA以及酶联荧光法[ELFA])检测抗HCV抗体的试验都已经上市。在这些试验中应用最广的有Prism Anti-HCV试验(Abbott Diagnostics,Wiesbaden,Germany),Architect Anti-HCV 试验(Abbott Diagnostics,Wiesbaden,Germany),ADVIA Centaur Anti-HCV试验(Siemens Medical Solutions Diagnostics,Bad Nauheim,Germany),Vitros Eci aHCV试验(Ortho Clinical Diagnostics,Neckargemuend,Germany),Elecsys Anti-HCV试验(Roche Diagnostics,Penzberg, Germany)和VIDAS Anti-HCV试验(bioMérieux,France)。一些对这些试验的性能进行比较的多中心研究显示,这些试验的灵敏度和特异性接近,灵敏度和特异性均大于99%,一致性良好,结果的变异性很低。但是,其他一些研究的结果出现了例外,这和一些ELISA试验的特异性和血清转化灵敏度有关。快速抗HCV抗体检测现在已经可以作为高风险人群以及普通人群筛查初步血清学评估的额外选择。这些试验的灵敏度可能介于25%-100%之间。


尽管这些试验的灵敏度很高,但是接受血液透析的患者和因自身免疫状况导致免疫功能不全的患者可能会出现假阴性结果。另一方面,试验的高灵敏度可能因非特异反应性导致假阳性结果,原因可能是光密度低或指数低导致结果偏弱,进而导致结果解析错误。但是光密度高或指数高(个人观测)也可能导致假阳性反应,这意味着任何仅基于观测信号密度做出的真或假的反应性结论都是不成熟的。在这种情况下,进行进一步试验确认阳性结果很有必要。但是许多实验室因多种原因导致日常补充检测的执行程度低,这些原因包括试验复杂性高、周转期长以及补充试验的成本高等。


抗HCV抗体检测试验的特异性很高。但是还是观测到了假阳性结果,这主要是因为有些人群HCV感染的患病率较低(低于1.0%),这些人群包括免疫功能不全的个体、献血者、军人和普通人群。这些假阳性结果的出现不仅取决于采用的试验,还与人群的人口学特征有关,假阳性率介于0.6%—3.6%之间。


应该强调的一点是,无症状个体的抗HCV抗体检测不需要说明是否为近期暴露导致的急性感染。首先,确定近期急性感染的诊断需要基于血清转化转变为阳性的抗HCV状态(但是许多研究对这一点存在争议),因此有必要了解个体先前的血清学状态,而大部分个体之前不是这种状态。其次,临床表现可能是先前未诊断出的慢性感染急性发作所致。最后,85%—90%的急性HCV感染是没有症状的,临床表现可能是由与HCV感染无关的其他肝病原体感染所致,因此进行鉴别诊断很有必要。即使在证明存在临床感染的情况下,血清学标志物的阳性结果也需要额外的血清学和分子试验来确认最初的检测结果,区分急性感染和慢性感染急性发作来鉴别既往HCV感染(已清除的感染)的血清学记忆病例。通过第二次血清学检验(EIE/CIA)来确定阳性结果,第二次检验利用与第一次检验不同的免疫显性区域抗原或免疫印迹试验进行确认。检测血流中的HCV基因组显示活动性感染可以确认慢性HCV感染急性发作或急性感染的诊断,缺少HCV RNA检测会显示病毒清除,15%的HCV感染病例会出现血清学记忆诊断。感染后,血流中永远可以检出抗HCV抗体。但是,抗HCV反应性下降,最终会发生血清转化,曾经有感染后自发清除的病例或治疗前持续病毒学反应的病例。


总之,IgM抗体不具有诊断HCV感染的实际价值,现有的检测方法仅包括在血清内检测抗HCV抗体和/或HCV RNA。但是,值得注意的一点是,尽管这类检测能区分既往感染、清除的HCV感染和最近感染,但是这类试验不能区分急性感染(或慢性)和慢性感染急性发作。

考虑到缺少特异性急性HCV感染的血清学标志物,抗体亲和力评估可能是近期病毒感染可靠的早期标志物。因为低亲和力抗体通常表示近期感染。抗HCV抗体检测的商购免疫分析试验已经经过优化,可以评估血清和干血斑样品中抗体的亲和力。此外,正在基于慢性感染个体的血清样品和血清转化来研发“室内”抗HCV IgG亲和力试验。


HCV基因组检测是最佳的近期感染诊断策略,因为HCV/RNA可以在感染后11-12天内检出,因此显著缩短窗口期是血清学试验的特点。不仅如此,对于HBV而言,使用这类检测与输血环境中受感染血液的早期鉴别存在莫大关联,但是作为日常诊断工具使用则会产生不必要的负担。


丁型肝炎病毒(HDV)


抗HDV IgM

丁型肝炎病毒(HDV)是丁肝病毒属的一员,并具有小型循环RNA基因组。具有需要存在HBV才能感染肝细胞的独特特征。和HBV一样,HDV传播可以通过性接触(精液或阴道分泌物)、血液(针头刺伤、药物或毒品注射以及输血)和围产期传播,吸毒是主要的HDV传播风险途径。HDV在全世界均有分布,社会经济水平较差的亚洲和非洲以及欧洲部分地区是HDV发病率较高的地区,如土耳其、蒙古、意大利南部和独联体国家。


由于HDV和HBV之间存在至关重要的联系,HDV只能在存在HBV感染时才能传播且取决于之前被感染个体的乙肝表面抗原(HBsAg)状态。这种传播模式是一种共感染模式或双重感染模式。共感染定义为易感个体同时感染HBV和HDV,导致同时发生急性乙型肝炎和丁型肝炎。双重感染定义为已经感染慢性HBV的个体发生HDV感染。在这两种感染模式中,有望检出抗HDV IgM抗体。因此,在检出HDV IgM抗体时,患者就称之为HDV疑似感染病例。


急性丁型肝炎的临床症状与报告的其他类型的病毒性肝炎症状并无二致,但是更加严重。感染后存在3—7周的潜伏期,是HDV复制的时期。在这一时期内没有诸如疲劳、厌食、嗜睡、恶心等肝炎症状,但是血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平和天冬氨酸转氨酶(AST)活性会显著升高,伴随着病毒复制的减少。一般来说,在感染后的大约4周可以检出抗HDV IgM,但是之后直到疾病发作前的数周内则不能检出抗HDV IgM。


血清学上检出抗HDV IgM定义为共感染,通常血清内会检出较低水平(随后发生抗HDV IgG抗体血清转化)和高水平HDV RNA,此外还会检出抗HBc IgM抗体。双重感染定义为血流中检出抗HDV IgM同型抗体(随后检出抗HDV IgG抗体)和与之有关的抗HBc IgG抗体。但是,双重感染可能不会出现抗HBc IgM抗体。由于抗HDV IgM抗体可以在这两种临床环境中检出,仅在检测一连串HDV和HBV标志物后才能实现鉴别诊断,每种临床环境的标志物结合应用模式也不同。


因此,基于血清学特点定义HDV/HBV共感染和双重感染,检测抗HDV IgM抗体可以诊断急性HDV感染。因此,抗HDV IgM抗体是实验室日常疑似丁型肝炎病例筛查的不二选择。尽管该试验的特异性很高,但是需要注意的一点是该试验经常会检出慢性感染个体。此外,临床实践中还有治疗后复发的病例。这意味着抗HDV IgM不仅是急性感染的标志物,还是HDV复发的标志物,正如其他发展为慢性的病毒感染中所观测到的那样,感染复发期间,血流中可检测出急性感染的标志物。最后,在治疗后血流中的抗HDV IgM抗体仍处于可检测的水平,导致很多实验室出现误诊。因此应该仔细解读抗HDV IgM的阳性结果,考虑到所有的可能性。


HDV抗原的检测是另外一种急性HDV感染诊断的选择,如果不是HDV抗原在血流中存在的时间很短,可能导致假阴性结果,这种方法就可以付诸实施。检测HDV基因组是急性HDV诊断的绝佳选择。目前,一些商购试验已经可以实现HDV RNA的检测和定量,但是至少对于非基因型-1 HDV样品而言,这些试验性能较差(标准化程度低/缺乏校准)。此外,基于不同方法的室内试验也正在研发中,但被限制使用。


为了实际进行急性丁型肝炎病毒感染的诊断,第一步是检测HBsAg阳性个体的HDV抗原抗体(IgM和IgG)(抗HDV)。在抗HDV阳性患者中,下一步是检测血清中的HDV RNA来测定抗体是否反映进行中的活动性HDV感染(HDV RNA阳性)或是既往HDV感染的血清学指标(HDV RNA阴性)。因此HDV感染依靠抗HDV IgM和IgG抗体的检测,然而HDV RNA的检测/定量尽管作用有限,但却是目前确认HDV复制状态的唯一准确诊断工具,可以对感染患者进行最佳的管理。


商购HDV血清学试验已经上市多年且应用广泛。而且多种不同的标准化试验检测抗HDV IgG抗体的结果显示出绝佳的一致性。当前一些日常使用的IgM抗体检测试验的灵敏度有些不同,尤其是样品中特异抗体的滴定量较低时。利用μ捕捉免疫分析方法可以测量HDAg(IgM抗HD)的IgM抗体。现有的商购试验包括ETI-Delta-IgMK2试验(Sorin,Saluggia,Italy),anti-HD EIA(Abbott),Anti-HD IgM试剂盒(Serono,Italy)和Diagnostic Bio-Probes(Milan,Italy)。在分子诊断中,尽管标准的商购试验存在局限性,但是美国一种一步法TaqMan定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)试验已经被开发出来用于HDV RNA的检测,在准确测量病毒载量方面的可靠性很高。


在HDV阳性患者中,区分急性HDV和HBV感染(共感染)以及慢性HBV感染患者的双重感染非常关键,因为这两种情况的处理和预后不同。共感染通常会导致急性自限性肝炎,这种肝炎不能在临床上与乙型肝炎进行区分。由于需要HBs抗原血症支持HDV复制的过程非常短暂,大多数时候急性丁型肝炎可以完全治愈,这也是急性乙型肝炎的特点,仅有2%的病例会发展为慢性肝炎。但是共感染可以导致严重的或爆发性肝炎。双重感染的结局比较多样,尽管通常仅会导致严重的急性肝炎。在临床上它可能加重已存在的乙型肝炎,或在先前已知的无症状HBsAg携带者身上作为一种新的肝炎出现。由于HBsAg状态为HDV的持续复制提供温床,所以超过90%的双重感染HDV的慢性HBsAg携带者会发展为慢性丁型肝炎。


戊型肝炎病毒(HEV)


抗HEV IgM

戊型肝炎病毒(HEV)是一种隶属于戊肝病毒科的RNA病毒,该病毒具有明显的流行病学模式且和四种基因型有关。在医疗条件较差的地区,HEV1和HEV2在人与人之间通过粪口途径传播,通常是受污染的水源。这时仅会造成零散病例和偶尔的大规模爆发。基因型3和4毒株多出现于发达国家,能够感染人和其他动物,在动物宿主间传播。由于诊断工具和筛查策略的改进,近些年零散病例的报告有所增多。感染基因型3的病例有可能发展为慢性肝炎。


HEV感染可以通过检测抗HEV抗体间接诊断,或通过检测血液或其他体液中的病毒基因组直接诊断。典型的感染存在2周到2个月的潜伏期,接着病毒会进入到粪便中,伴随临床症状的出现病毒血症消失,感染后的大约2—3周可能出现黄疸,同时病毒消退。


潜伏期后,在出现抗HEV IgM反应(可能持续时间很短)后,IgG抗体可能长期存在。感染的临床表现包括检出高水平IgM抗体,抗体在8周内维持相对较高水平。之后,这些抗体的水平迅速下降,大部分患者在32周后抗体水平下降到低于临界值。大约在症状出现4周后可以检出高水平的IgG,并将维持高水平达1年时间。抗HEV IgG抗体反应的精确时长仍然不明。


先前研究中观测到的急性HEV感染准确诊断的主要局限性之一是检测特异IgM抗体的标准化试验的灵敏度和特异性存在很大差异,而且这些试验的一致性也较差。这些试验的灵敏度介于72%—98%之间,特异性介于78.2%—95.6%之间。差异性大的原因可能是试验标准化的方法不同。使用灵敏度为72%及以下的试验不足以诊断特异抗体水平低的急性病例,并能导致假阴性结果。另一方面,一些试验的特异性低(低于80%)导致不能检出特异IgM抗体,引起假阳性结果。


如上所述,人感染HEV有2种明显的流行病学模式,涉及4种基因型。这些试验观测到的检测灵敏度差异可能与性能评估有关,这些试验的性能评估基于感染2种HEV基因型或仅感染一种HEV基因型的患者的血清样品分析,然而用于抗HEV免疫球蛋白IgM检测的试验可能不具有基因型特异性,因此导致检测能力的差异。值得注意的一点是基因型1、2、3和4的流行因地理区域的不同存在差异。如果试验基于基因型的抗体检测灵敏度不同,则试验的性能可能因使用该检测试验区域流行的基因型不同以及在该区域试验检测的流行基因型的灵敏度不同而存在差异。因此,在临床实践和疾病监测中,还是要依靠不受感染毒株基因型影响的HEV感染检测试验。


除了与抗HEV试验相关的局限性,已经执行了一项评估8种商购试验(检测基因型1和3 HEV感染的HEV血清抗体IgM和IgG特异性ELISA)的分析性能和临床性能的研究。该研究显示来自Wantai Biological Pharmacy(PE2试验Beijing,China)和MP Diagnostics (IgMv3.0;MP Biomedicals,Singapore,formerly Genelabs [GL])的HEV ELISA具有最佳的分析灵敏度,其临床灵敏度(75%和74%)足以诊断临床环境中的HEV基因型1和基因型3感染。这些试验中,试验微孔板仅结合基因型1和2抗原。第二项研究发现欧洲普遍适用的另一种IgM试验具有良好的灵敏度,该试验为Adaltis试验(除wantai试验外),通过检测来自40个免疫功能不全患者和44个具有免疫活性的急性HEV感染患者的样品得到了上述结论。该试验检测具有免疫活性的患者灵敏度达到97%,检测免疫功能不全患者的灵敏度达到了85%—87%。急性感染期间采集的样品没有出现抗HEV IgM阴性和抗HEV IgG阳性结果,这两种IgM试验都具有高特异性(99.5%)。


如上所述,可能出现慢性感染病例。这些病例与感染基因型3的免疫抑制患者有关。在这种情况下,抗HEV IgM试验可以作为一线诊断试验。但是,对这些患者而言,由于存在可能的未检测出的抗HEV IgM抗体,还需要HEV RNA试验进行HEV感染诊断。出现未检出抗体的原因是(1)免疫反应延迟或受损;(2)该人群使用的IgM试验性能较差。对于免疫功能不全的患者而言,HEV RNA试验是鉴别慢性感染的关键,因为如果HEV RNA持续出现3个月,则患者在无治疗干预的前提下很可能不能实现自发病毒清除。


其他影响抗HEV IgM抗体有效检测的因素包括标本采集延迟、IgM在血清内存在时长较短等。此外,必须考虑免疫因素,因为对HEV感染免疫反应较弱的急性感染患者有可能导致抗HEV IgM不能检出。


尽管一些试验灵敏度较低,但是疑似HEV感染无症状个体中抗HEV IgM的存在还是值得研究。因为仅有35%的HEV感染会有症状,儿童(低于14岁)无症状感染的百分比更高。


考虑到一些急性病例可能不能检出IgM抗体,如果在潜伏期或症状出现早期使用基因组扩增试验,则基因组扩增试验就成为这些病例重要的诊断工具。但是,考虑到HEV RNA在症状出现3周后才能在血液内检出,如果患者在疾病出现症状的时期内采样较晚,则会发生HEV RNA结果呈现阴性的情况,但这不能排除近期感染的可能性。


现在,人们认识到HEV是地方病国家、西欧本地急性肝炎病例和东亚工业化国家零星急性肝炎病例的主要致病病原体。


庚型肝炎病毒(HGV)


HGV/RNA

庚型肝炎病毒(HGV)或GBV-C(G. Barker病毒-基因组C)是一种黄病毒。HGV在世界范围内分布很广,一般人群的感染率为1.7%。该病毒主要在献血人群中检出,但是多次输血人群、慢性肾病患者、吸毒者和血友病患者均为高风险人群,发病率较高。HGV主要通过非肠道途径传播。但有证据表明性接触或垂直途径也可传播。

尽管大部分HGV感染没有症状,感染该病毒的临床意义也仍在研究中,但是暴露于HGV后潜伏期大约为14—20天,会发生急性感染。感染会向恢复阶段演进,血清HGV RNA会消失,抗E2抗体会出现,或在HGV RNA持续可检出的情况下发展为慢性肝炎。已经有HGV相关爆发性肝炎病例的报告。


目前,早期HGV诊断的血清学试验尚未广泛应用到临床和实验室实践中。因此已经研发出检测抗HGV IgM抗体的酶联免疫吸附试验。尽管该试验的性能良好(灵敏度和特异性),但是还未进行日常应用的标准化工作。已经研究出另外一种检测抗HGV包膜蛋白E2抗体(抗E2)的血清学试验(EIE)。这些抗体在暴露于HGV的个体中被发现,但是罕有在HGV RNA呈阳性的个体体内检出,因此将其定义为HGV感染恢复期诊断标志物,是一种很有价值的流行病学标志物。


在缺少可靠的急性感染血清学诊断试验的情况下,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HGV RNA仍是唯一可行的进行中HGV感染的检测方法。关于解旋酶(NS3)和NS5A区域的DNA区域编码序列数据正在用于合成寡核苷酸引物。 


该方法因在多种病毒隔离种(灵敏度为200拷贝/mL)中的该区域具有较高的稳定性(83%—99%)而被采用。这些试验已经成为所有HGV感染研究的基础,无论是急性感染还是慢性感染的诊断。


外周血淋巴细胞和单核细胞内已经检出了HGV RNA,血管内皮细胞和肝细胞内水平较低。大部分感染GBV-C/HGV的具有免疫活性的个体在感染的2年内能实现病毒清除。


表1总结了肝炎病毒急性感染标志物的特点,包括其血流动力学(病原体感染后的持续时间和可以检测的时长)和与血清学标志物相关的限制因素以及能影响准确诊断的因素。


结论和评论


肝炎病毒引起的急性感染的临床和实验室诊断可能被一些因素复杂化。第一,至少存在5种能导致感染的病原体,这些病原体导致的症状、伴随的临床表现以及实验室异常状况缺少特异性。第二,很有必要首先(至少在理论上)对每种病毒执行实验室检测,尤其是患者的流行病史和行为史以及病原体流行病学都未知的情况下。第三,急性阶段的血清学标志物的存在不能总是指示急性感染,有时这些标志物在急性感染期间不能被检出。第四,用于诊断的试验存在局限性,试验的灵敏度、特异性和可能较差的反应性可以脱离医护工作者的控制且不会引起医护工作者注意(尤其是实验室工作人员)。第五,感染中采集样品的时机不当,医护工作者对每种病原体急性感染标志物的动力学的注意力(或知识)不足导致产生错误结果。第六,宿主相关因素如年龄、存在基础疾病或与免疫反应相关的因素(如免疫抑制)会干扰特定试验检测抗体的能力。这些因素能影响急性肝炎的诊断,导致相关病原体的诊断产生不确定性。此外,尽管试验具有灵敏度和特异性(可能有限),但是干扰因素还会导致模棱两可或不一致的结果。


考虑到这种情况,值得注意的一点是病毒的流行病学和患者的流行病学背景。采用这些数据后,对于那些不太可能出现的病毒可以不再进行检测(降低不必要的成本,更快地获得结果),优先考虑检测与疑似病例最具相关性的标志物。对于阳性结果,无论是否可能,都应该附有患者的临床、流行病学和行为特征信息,这有助于结果确认。否则,就需要一直考虑假阳性结果出现的可能。如果对有急性感染症状的阴性结果一直持怀疑态度,那么就需要考虑假阴性结果的可能性,就应该执行分子检测试验。最后,实验室工作人员和临床医师需要了解感染的免疫学和六种病毒急性期标志物的动力学相关的最基本的知识,应该注意所有血清学试验的内在局限性。


尽管本文中对分子试验和血清学试验的局限性进行了警示,但是技术的进步已经能够及时设计出可以提供更加精确可靠结果的高灵敏度和高特异性筛查试验。在了解(或强调)用于急性诊断的试验的局限性的同时,尽管检测所采用的试验性能良好,但本文的目的其实是引起实验室工作人员和临床医师对可能影响结果可靠性的因素的注意。此外,本文的另一个目的是在急性肝炎的诊断中,对急性期标志物的相对(绝非绝对)准确性提出警示。这是因为IgM抗体的阳性(或阴性),是唯一的一种急性期血清学标志物,往往被认为是正确,但是这并不总是正确的。

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(参考文献略)

摘自《Arch Virol》,版权归其所有仅供内部参考

编译:张凯

审校:方妍


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