成人T细胞白血病: HTLV-1感染的T细胞的转化和克隆扩增的分子基础

发布时间:2017-05-02       作者:Toshiki Watanabe       来源:临床实验室        浏览:3145       收藏: 0

摘 要:成人T细胞白血病(ATL)是一种侵袭性T细胞恶性肿瘤,该疾病由人体T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)引起,通过涉及5个或更多的遗传事件的多个步骤发展进而癌变。本文中,我们将提供揭示ATL白血病生成分子基础的相关信息。在更加广泛的意义上说ATL的遗传异常包括T细胞受体-NF-kB信号在基因上的高度集中变化如PLCG1、PRKCB和CARD11以及CCR4和CCR7获得功能突变。相反,ATL的表观遗传变化可以总结为多梳抑制复合物2超活化,全基因组H3K27 me3积累成为ATL细胞独特转录组的基础。HTLV-1 Tax和NF-kB诱导了zeste 2 H3K27甲基转移酶增强子的表达。不仅如此,先前使用高通量测序的整合位点分析让每个克隆体的细胞数量和克隆成分的体内分析成为可能,然而CD7和细胞粘着分子1的多色流式细胞分析能够在体内鉴别HTLV-1感染的CD4+T细胞。经过分类的无限增殖但未转换的细胞显示出表观遗传变异紧密地覆盖了那些观测到的处于转换末期的ATL细胞,这表明在白血病形成的过程中表观异常很可能是较早发生的事件。这些新的发现扩展了白血病生成、无限增殖和克隆累进的分子机制的概念。这些新发现还开拓了ATL预防和治疗药物研发的新方向,因为可以重新编译表观遗传标记。潜在的最初的无限增殖和异常进行性累进的机制仍有待阐释。

简 介:成人T细胞白血病(ATL)是一种侵袭性T细胞恶性肿瘤,该疾病由人体T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)感染引起,经常发生在HTLV-1地方病病区如日本西南部、加勒比岛屿、中南美洲、非洲热带地区和中东。在日本,大约110万人携带HTLV-1。据估计全球携带HTLV-1的总人数介于500万至1000万人之间,由于缺乏发展中国家的流行病学信息,因此携带者的数量应该被严重低估了。实际上,基于国家人口统计数据,日本每年有接近1000人死于ATL。然而其他国家的死亡率信息非常有限。发病的年龄也随着地理位置的不同而变化:中南美洲的平均诊断年龄为接近40岁,显著低于日本的平均诊断年龄(接近60岁)。据估计日本HTLV-1携带者ATL的终生风险为男性6%-7%,女性2%-3%。此外,在儿童时期,HTLV-1感染个体可能会优先发展为ATL,但在成人阶段感染者很少发展为ATL。较高的前病毒载量(>4复制数/100外周血单核细胞)是ATL进展的独立风险因素。病毒传播的途径为母婴传播、性行为传播和输血传播。虽然先前有ATL通过器官移植传播的案例,但是,ATL是否会在性接触或输血后水平传播仍然未知。我们最近的研究揭示了超过4000个处于青春期和老年期的HTLV-1新感染案例,揭示了具有水平传播HTLV-1携带者中HTLV-1相关疾病研究的重要性。


世界范围内ATL的发病年龄随着地域的不同而变化,家庭群发ATL的证据强烈表明环境和遗传因素关乎疾病的结局。关于遗传背景,已经表明许多基因是疾病易感性的决定因素,例如HLA class1、肿瘤坏死因子α和杀伤免疫球蛋白样受体。但是,由于缺乏大型研究,关于这些问题还没有明确的结论。


和其他逆转录病毒类似,整合的HTLV-1前病毒基因组包含2个长末端重复序列、氨基葡聚糖、多糖和膜蛋白。基因组还有一个额外的指定的pX序列,该序列与编码蛋白质p12、p13、p30、Rex和Tax的开放阅读框架有部分重叠4处。调节蛋白、p12、p13和p30在体内HTLV-1感染的形成和维持中发挥重要作用。其他调节蛋白Rex和Tax在阳性和阴性途径中联合调节HTLV-1基因的表达和复制。Tax是病毒转录激活蛋白还是参与细胞基因表达的调节器,这些细胞基因表达主要通过激活NF-kB和AP-1途径参与T淋巴球的增殖。Tax表达细胞绕过细胞周期检查点,影响参与DNA损伤反应和凋亡途径的机制,并导致遗传和表观蚀变以及RNA稳定性改性的累积。Tax在啮齿类动物纤维母细胞和主要的人体淋巴球中具有转化活性,具有多种激活子Tax转基因小鼠发展为包括T细胞白血病的肿瘤。因此,Tax是参与感染细胞转化和无限增殖的主要病毒性因素。


HTLV-1还表达一条负链RNA,影响基础亮氨酸拉链和HTLV-1bZIP因子(HBZ)的编码。HBZ信使RNA(mRNA)能促进ATL细胞的增殖。通过与细胞蛋白的相互作用,HBZ呈现出多种功能,一些功能可以对抗Tax。HBZ在致癌过程中发挥着重要作用,因为它能一些依靠HBZ诱导的miRNA驱使感染的细胞增殖,增强hTERT转化,抑制细胞凋亡破坏宿主基因组完整性。HBZ转基因小鼠体内CD4+T-淋巴细胞特异性表达诱导1/3的T细胞淋巴瘤以及全身炎症。HBZ mRNA在所有HTLV-1感染的细胞内表达,包括体外ATL细胞,这表明它在HTLV-1感染的T细胞的转化、增殖和维持中发挥关键作用。


ATL的临床特点和治疗



ATL在临床表现中显示出显著的多样性:白血病临床表现、普遍的淋巴结病变、肝脾肿大、皮肤损害、高血钙症、其他器官如中枢神经系统和胃肠道浸润。由于高血钙症和/或机会性感染ATL的症状和表现包括腹痛、腹泻、腹水、黄疸、胸腔积液、咳嗽、痰多、发热和意识不清。基于Shimoyama等人的诊断标准:浸润点、存在白血病临床表现以及表现的水平、乳酸脱氢酶水平和高血钙症,ATL分为4种临床亚型(即无症状缓慢发展型、慢性、急性和淋巴型)。


大部分案例的ATL细胞表达CD3、CD4和CD25但缺乏CD7。在10%到15%的案例中,ATL同时表达CD4和CD8。基于一些肿瘤细胞中FoxP3的表达ATL细胞的起源可能是调节T细胞,这个结论目前存在争议。


ATL治疗策略的国际共识基于临床亚型、预后因素和初步治疗的反应。对于患有侵袭性ATL的患者(急性、淋巴型和预后因素较差的慢性ATL),除了淋巴型患者外建议使用加强型化疗方案如VCAP-AMP-VECP(长春新碱、环磷酰胺、阿霉素和强的松;阿霉素、雷莫司汀和强的松;长春地辛、依托泊苷、卡铂和强的松)或齐多夫定/干扰素α(AZT/IFN-α)联合疗法。对于懒惰型ATL(无症状缓慢发展型和不存在较差预后因素的慢性ATL),建议使用观察等待治疗或AZT/IFN-α联合疗法直到疾病发生进展。在美国和欧洲,利用AZT/IFN-α的抗病毒疗法是淋巴型ATL的标准治疗方法。在欧洲,化疗是淋巴型ATL的一线疗法,因为单独使用AZT/IFN-α疗法的总存活期(OS)非常短。日本未引进AZT/IFN-α疗法,因为日本国民健康保险体系还没有批准利用这两种药物对ATL患者进行治疗。AZT/IFN-αVS观察等待疗法治疗无症状缓慢发展型ATL的随机阶段3临床试验正在进行中。该临床试验将提供关于无症状缓慢发展型ATL最优化标准治疗的决定性信息。不仅如此,已经有小型研究联合AZT/IFN-α和三氧化二砷治疗慢性ATL患者的报告。体外试验显示增加三氧化二砷能诱导Tax降解退化。大型临床研究将提供这种新策略的决定性评估结果。其他的策略包括直接对患有侵袭性ATL的相对年轻的患者移植同种异体造血干细胞,以及使用去岩藻人乳化抗CC趋化因子受体4(CCR4)单克隆抗体(mogamulizumab)治疗复发或难治型CCR4阳性侵袭性ATL。


ATL的预后仍然很差。最近日本的一个研究小组对1594名ATL患者进行了研究并报告了治疗和存活结局:急性、淋巴型、慢性和无症状缓慢发展型ATL亚组的中值存活期分别为8.3、10.6、31.5和55个月,4年OS率分别为11%、16%、36%和52%。他们还发现近20%的接受同种异体造血干细胞移植的急性和淋巴型ATL患者的中值存活和4年OS率分别为5.9个月和26%。因此,尽管最近治疗方法出现了进步,但是患有急性和淋巴型ATL患者的预后仍然不能令人满意;然而,他们发现与先前研究相比,此次的4年OS要好一些。与此相反,无症状缓慢发展型ATL的预后比预期要糟糕,接受移植的患者中仅有25%的患者实现了长期存活。


ATL的基因表达异常



mRNA的表达

ATL细胞表达细胞因子、趋化因子和趋化因子受体以及粘着分子,这些物质中的大部分都是病毒反式激活因子蛋白质Tax的目标。细胞粘着分子1(CADM1),一种最初被分离作为非小细胞肺癌肿瘤抑制因子的细胞表面分子,在携带者的ATL细胞内和HTLV-1感染的非转换T细胞内高度表达。通过流式细胞分类法分析,CADM1目前用于鉴别HTLV-1感染的T细胞。甲状旁腺激素相关蛋白是另一种在ATL细胞内高度表达的蛋白质,一半以上患者临床过程中观测到的肿瘤体液高血钙症是这种蛋白发挥作用的结果。其他在ATL细胞内高度表达的因子包括白介素-1、转化生长因子β、肿瘤坏死因子β和核因子k-B配体受体激活剂,这些物质都参与ATL患者的高血钙症,这表明这一特征明显的副肿瘤综合征的机制非常复杂。细胞粘着分子和趋化因子受体的过表达似乎能促进ATL细胞的器官浸润。这些发现的一个有趣的现象是T细胞内的基因表达都不正常,随后的表达阵列研究确认了这一现象。ATL细胞内许多世系独立基因的表达异位,这表明表观遗传调节异常决定了组织的特殊基因表达。


miRNA的表达

主要ATL细胞和HTLV-1/ATL细胞系miRNA表达图谱的研究证明一定数量的miRNA发生了上调和下调。HTLV-1转化的细胞系内,miR-21、MiR-24、miR-146a和miR-155被上调,但是miR-223被下调。在主要的ATL细胞内,通过微阵列分析miR-181a、miR-132和miR-125a被下调,然而miR-155和miR-142-3p被下调。但是另一研究中,总共6个miRNA被上调,miR-93和miR-130以TP53INP1肿瘤抑制因子为目标。我们对主要ATL细胞miRNA表达特征的研究证明绝大部分表达有区别的miRNA被下调,对miR-31的抑制最为严重。有意思的是我们发现miR-31以MAP3K14(NIK)为目标,该物质在ATL细胞内过表达,基本激活了NF-kB途径。


信号传导

大量的文献已经表明HTLV-1感染的细胞系和主要ATL细胞内的信号传导途径有异常。人们广泛认同的是HTLV-1 Tax通过直接与信号分子发生相互作用激活多条信号通路。但是,这些信号途径仅有特定方面被确认在在缺乏Tax时在主要ATL细胞内激活。因此Tax介导的信号途径激活似乎参与较早阶段的转化,而且转化的细胞保持一些持续性激活的途径,这些途径是ATL细胞凋亡耐受和增殖的关键。其中最广为人知的粒子是NF-kB途径,该途径在ALT细胞内持续激活NF-kB在ATL细胞内缺乏Tax时持续激活的机制是miR-31抑制导致的NIK过表达。抑制NF-kB可以诱导ATL细胞凋亡而且尤其能减少无症状携带者体内HTLV-1感染的T细胞的数量。磷脂酰肌醇3激酶/AKT级联也是ATL细胞内持续激活的途径,能够诱导ATL细胞多囊性核子特征的形成。不仅如此,由于超过30%的ATL患者体内发现Notch内突变被激活,所以Notch信号途径被持续性激活。发现25%的患者存在FBXW7内的突变,阻碍了FBXW7和细胞内Notch(NICD)之间的相互作用,导致蛋白质稳定性提高和持续的Notch1信号。最后,Jak/STAT途径,另一个ATL细胞内的信号途径,这个途径与细胞的增殖有关。尽管在存在Tax时还有一定数量的其他信号途径显示出异常,但是它们在主要的ATL细胞内特征不明显。ATL细胞内异常的基因表达和信号传导和HTLV-1感染和表达病毒的T细胞相同,尽管病毒基因,除了反义转录,未在ATL细胞内表达(图1)。

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图1. HTLV-1感染的细胞和转化的ATL细胞分子异常的比较

ATL细胞表型的许多方面和未转化的HTLV-1感染的T细胞表达的病毒蛋白质有很多共同特点,包括Tax。Tax诱导大部分的HTLV-1感染的细胞中的分子变化,大部分的变化也存在于没有表达Tax的ATL细胞内。因此,这个现象有时叫做Tax签名。CARD11;半胱天冬酶补充域包含的蛋白质11、GPR183,G蛋白结合受体183;NRXN3,轴突蛋白-3;PLCG1,磷脂酶C、γ1;PRKCB、蛋白激酶Cβ。


ATL的基因组异常



细胞遗传学特征

大部分患者的ATL细胞存在多种细胞遗传学异常;但是尚未发现特殊重组或扩增/缺失事件。特定的染色体畸变与1个或多个临床特征和临床严重度有关。比较基因组杂交分析也揭示畸变水平与临床过程有关。最常见的畸变包括获得染色体14q、7q和3p和丢失染色体6q和13q。染色体失衡、丢失和获得在侵袭性ATL案例中较为常见,在无症状缓慢发展的ATL案例中较为少见。疾病进展期间的连续样品分析显示危险期的克隆变化;ATL进展期间克隆多样性较为常见,染色体异常与临床过程有关。


特殊基因的异常

体细胞突变或表观遗传机制导致的肿瘤抑制因子失活在癌症领域非常常见,这个现象参与肿瘤发生与发展的过程。在ATL中,主要的遗传事件围绕着依赖细胞周期素激酶抑制剂如p15(INK4A)、p16(INK4B)、p18(INK4C)、p19(INK4D)、p21(WAF1)、p27(KIP1)、和 p57(KIP2)以及p53和成视网膜细胞瘤(Rb);在G1/S细胞周期转变期间这些基因发挥着调节作用。侵袭型(急性或淋巴型)ATL的p15(20%)和p16(28%-67%)经常发现异常,但是懒惰型ATL(慢性和无症状进展缓慢的ATL)p15(0%-13%)和p16(5%-26%)发现的异常较少。大部分的变化为基因缺失;突变发生的频率较低。缺失p15和/或p16的患者的存活期显著较短。P18、p19、p21和p27很少出现遗传变异。


与之相反,在10%-15%的侵袭性ATL病例中p53基因出现突变,但是懒惰型ATL中,p53突变的频率较低。这些数据明确表明与细胞周期相关基因的突变与ATL进展和更严重阶段的ATL的相关性很可能比该肿瘤更早期的临床阶段更高。


大部分ATL患者的白血病细胞和HTLV-1转化细胞系包含水平升高的功能性不活跃的野生型p53蛋白。仅仅HTLV-1 Tax肿瘤蛋白就能去除p53的反式激活功能,在Tax不能与p53结合时保持稳定。此外,HBZ能通过抑制p300和HBO1组蛋白乙酰转移酶的活性抑制p53功能。假设HBZ在所有HTLV-1感染的细胞内保持稳定的表达,这些数据可能提供解释大部分案例中ATL细胞内不存在Tax时p53失活机制的线索。


Rb肿瘤抑制基因在结构中变化并不频繁;但是多达50%的案例显示Rb蛋白缺失。此外,低水平的Rb表达与较差的预后和较短的存活期有关。


显然,任何一种依赖细胞周期素激酶抑制剂的变化,如p53或Rb似乎可以不需要让其他基因在相同的途径失活。总之,肿瘤抑制基因,如在侵袭性ATL中频繁变化的基因很有可能驱使着并加速肿瘤细胞的克隆进展。


ATL基因组异常的综合分析



最近,涉及426名ATL人群的综合基因组学和转录组学分析的结果已经发表。大量的基因组学甲基化组学和转录组学数据外加该研究中基于细胞的实验数据提供了综合而详尽的信息,让我们对ATL发病机理有了更深入的了解,确认了整合前病毒基因组出现缺失以及有义链表达的缺乏包括mRNA编码的Tax,与反式转录HBZ的持续性表达形成鲜明对比。


81个ATL案例进行了全基因组测序,结合对370份样品的针对性重新测序,鉴别出50种存在显著周期突变的基因;这些基因中的13种影响超过10%的案例。突变最为频繁的基因是PLCG1(36%)、PRKCB(33%)、CARD11(24%)、VAV1(18%)和IRF4(14%),这些基因全部与T细胞受体(TCR)-NF-kB信号有关。此外,CCR4或CCR7分别在29%和11%的案例中发生突变。不仅如此,CCR4 Tyr331和CCR7 Trp355是获得突变功能的位点。


相同的研究中对426个ATL案例记性了基于单核苷酸多态性阵列的拷贝数分析,该分析揭示了50个拷贝数减少和26个扩增事件。这些存在拷贝数异常的基因中的一些与基因突变位点重叠。为了描述这些结构性异常,对48份匹配的样品进行全基因组测序。结果是平均每份样品60次结构性变异(SV),包括常见脆性位点如14q31.1(NRXN3)、7q31.1(IMMP2L)、1p21.3(DPYD)和3p14.2(FHIT)的累积缺失。超过60%的ATL案例出现NRXN3缺失。这些结果进一步揭示了ATL细胞的基因组不稳定性。


额外突变的累积影响TCR和NF-kB途径,连同p53、p16的失活以及其他突变最终将T细胞转化为完全的恶性细胞。数据还显示ATL细胞缺失、变异或编码I类主要组织相容性复合体(MHC-I)成分的超甲基化基因、死亡受体和参与细胞粘着或免疫检查点的蛋白质是躲避免疫系统删除的策略(图2A-B)。


在研究SV的研究中,发现27%的ATL案例中,编程细胞死亡1配体(PD-L1)基因的3’区域被SV破坏。这些SV不约而同显著促进PD-L1异常转录,去除3’-非翻译区保持稳定。SV触发这一独特的遗传免疫逃避机制。


Nagata等人对203个ATL案例进行深度测序在广泛分布于整个编码序列但几乎都位于三磷酸鸟嘌呤核苷结合袋的30个病例中发现了RHOA突变。根据该突变类型和位置,这些对功能产生不同的影响,这表明RHOA功能的获得和丢失参与ATL白血病形成。


另一份报告显示SUZ12、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、TET1、TET2、IDH1、IDH2、MLL、MLL2、MLL3和MLL4出现了突变。TET2是突变最频繁的基因,32%的样品都发生了该基因的突变(10/31)。下一代测序揭示伴随着TET2和MLL3杂合性的缺失出现了无意义突变,这表明MLL3和TET2失活是HTLV-1诱导ATL白血病形成的重要原因。


相同的小组已经报告了20%-30%的案例中Notch-1信号、Notch PEST域和FBXW7/和CDC4中基因的激活的突变,这两者都表明有助于增殖和肿瘤形成。


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图2. ATL细胞遗传异常原理总结图

  • (A)TCR信号和NF-kB途径突变的累积;

  • (B)最小化突变的范例。基因内缺失和不同于参与TCR信号的基因内的突变。

  • (C)胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)岛甲基化表型可能的影响。CSNK2B,酪蛋白激酶II亚组B;CSNK1A1,酪蛋白激酶1亚组α1;HNRNPA2B1,异质性胞核核糖核蛋白A2/B1;IKZF2,锌指蛋白Helios。


ATL的表观遗传学异常



DNA甲基化异常

CDKN2基因座编码p16、p14和p15这样的蛋白,并参与细胞周期调节。它还是基因组和表观遗传学异常的热点。在我们的拷贝数变异研究中,168个案例中的46个(27%)在此基因座出现了基因组缺失。此外,CpG甲基化分析显示在47%的急性和73%的淋巴型ATL案例中,此基因座都出现了超甲基化,然而慢性和无症状缓慢发展型ATL案例中,甲基化的水平仅为17%。在另一份报告中,CDK2B的CpG甲基化水平高于CDK2A。相反,我们的ATL样品表达图谱没有显示CDKN2家族成员表达的任何下调。这强调了对ATL细胞的细胞周期调节因素的功能影响和表达水平进行详细分析的重要性。还报告了HCAD、SHP1、DAPK和其他与疾病进展相关基因的CpG甲基化的进展累积。CDKN1A(p21waf/Cip1)被DNA甲基化下调,这和我们的数据一致。这些结果表明异常DNA甲基化与细胞周期调节之间的关系以及在ATL中它们可能失去功能。


除了细胞周期调节因子,还报告了骨成型蛋白质6(BMP6)、腺瘤性肠息肉病(APC)进而CD26的DNA超甲基化。利用甲基化CpG岛扩增的代表性差异分析的筛查研究揭示了p53基因的异常DNA甲基化,包括那些参与凋亡耐受的基因如KLF4和EGR3。


Kataoka等人还报告了ATL CpG甲基化综合性描述。ATL基因组以突出的CpG岛DNA超甲基化为特征;在ATL中,转录抑制显著对更大数量的基因造成了超甲基化。大约40%的样品显示更加广泛的超甲基化,这称之为CpG岛甲基化表型(CIMP)。CIMP状态与侵袭性表型有关,但是与表观遗传调节因子的突变状态无关,在其他癌症中,突变状态与CIMP有关(TET2、IDH2、和DNMT3A)。此外,与内源性和外源性逆转录病毒同时抑制有关的C2H2型锌指基因被超甲基化和抑制。不仅如此,在许多ATL病例中MHC-I 被超甲基化和抑制,97%的ATL案例发现了了MHC-I表达缺失,这有助于ATL细胞的免疫逃避(图2C)。


尽管这些数据让我们对ATL细胞内DNA的甲基化状态有了初步了解,异常DNA甲基化的机制及其生物学显著性仍有待确定。


异常组蛋白修饰模式

多种化学组蛋白修饰核染色质结构和基因表达的调整。ATL的基因表达图谱以正常CD4+细胞显著逃逸为特点,同时基因编码的多种受体表达上调以及多种分化相关基因的独立世系异常表达(图1)。这些数据表明ATL细胞的组蛋白修饰存在复杂的畸形,提供了异常基因表达图谱的基本原理。但是,与DNA甲基化研究相反,直到最近ATL细胞组蛋白修饰的特征描述才取得了显著的进步,这主要因为技术上存在困难。


尽管ATL细胞的组蛋白乙酰化异常的特点尚未被明确表述,但是已经报告了ATL细胞和HTLV-1感染的细胞系内组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACis)引起的细胞凋亡诱导和NF-KB活性抑制。尽管一些评估ATL中HDACis 的临床试验正在进行,但是未来测定组蛋白脱乙酰酶异常的机制和HDACis效果的研究才是最重要的。


众所周知H3K27的三甲基化(H3K27M3)在存活、增殖、去分化、侵袭以及许多癌症如乳腺和前列腺癌和B细胞淋巴瘤远端转移中的作用。H3K27m3是真染色质区域基因表达抑制的标志物。多梳家族(PCG)蛋白形成多蛋白复合物,这些复合物是发展期间可在分化途径的数千基因的转录抑制子。PcG蛋白通过复合物内的2个主要PcG蛋白质的组蛋白化学修饰发挥转录抑制子功能,这些复合物是:多梳抑制复合物1(PRC1)和PRC2。PRC2包含zeste1增强子(EZH1)和EZH2发挥H3K27甲基化酶的作用。PRC1识别H3K27m3并诱导H2AK119遍在蛋白化作用(H2K119Ub),稳定染色质结构。


我们最近对ATL细胞依赖多梳表观遗传的特征进行了综合性研究,得到了破译ATL关键发病机理的ATL特殊表观遗传学代码。对主要ATL细胞的表观基因组(n=3)和转录组(n=58)的综合分析揭示PRC2成分,包括EZH2高度表达;一半以上的基因中(53.8%),H3K27m3被显著而频繁地重新编译。不仅如此,ATL中的H3K27m3模式与其他的癌症类型和依赖PCG的细胞系明显不同。我们的研究包括的50名ATL患者未发现EZH2突变。通过疾病从懒惰型向侵袭型的进展证明了基因表达的进展性下调。被下调的基因包括关键的基因如miR-31、BCL2L11、EVC1/2、CDKN1A和NDRG2。另一个发现是出现了由广泛的基因调节因子远程调节所致的不同结局,这些基因调节因子包括多种转录因子,miRNA、表观遗传学修饰基因以及发育的基因。外周T细胞确认了EZH1表达的增加补偿了EZH2的功能。总之,PRC2的超活化连同基因组层面的H3K27m3累积描绘了ATL表观基因组的特点。因此,证明由于shRNA同时缺失EZH1和EHZ2显著降低细胞H3K27m3的水平,与单独缺失1种EZH相比,显著抑制了ATL细胞的增殖,这表明EZH1/2的补偿作用对ATL非常关键(图3和图4)。

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图3. ATL细胞的表观遗传学图示

HTLV-1感染的细胞以及ATL细胞中观测到高水平的EZH2表达。Tax和NF-KB能诱导EZH2表达。ATL细胞的特点是PRC2过表达和H3K27m3累积,这些物质的水平随着克隆的累积而上升。

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图4. 作为ATL细胞表型基础的H3K27m3的累积

PRC2介导的H3K27m3累积抑制重要的基因如肿瘤抑制因子;miRNA,表观遗传学修饰基因以及转录因子,决定ATL细胞表型的下游基因调节异常达到峰值。

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图5. 克隆进展和表型变化的原理图说明

目前可以对体内HTLV-1感染的T细胞和ATL细胞进行分子分析。累积的数据表明表观遗传学异常发生在白血病生成的早期,微转化的HTLV-1幡然的细胞显示出在ATL细胞中观测到的表观遗传学证据。最近的研究已经详细描述了HTLV感染并向ATL进展期间的克隆活动的特点,提供了基于整合位点的克隆进展的信息。

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图6. 克隆进展和HTLV-1感染的T细胞的层次结构示意图


包含不同遗传异常的亚克隆整合位点定义克隆。在这些亚克隆中有一定的层次结构如Tscm细胞起ATL抑制干细胞的作用。Tcm,CD45RO+中央记忆T细胞;Tem,CD45RO+效应记忆T细胞;TN,CD45RA+幼稚T细胞。


体内HTLV-1感染的T细胞的克隆增殖和鉴别


携带者体内ATL细胞和HTLV-1感染的T细胞的克隆

利用HTLV-1前病毒DNA作为探针的Southern blot分析首次证明了ATL细胞的克隆增殖。除了罕见案例是通过ATL细胞内2个或更多的前病毒拷贝外,ATL细胞是通过HTLV-1感染的细胞单克隆扩增。后续的研究证明一些ATL患者体内的克隆体在疾病临床进程期间特定时间点同时多重克隆。还报告了临床进程之间的克隆交换。外周血和急性ATL患者淋巴结配对样品的阵列比较基因组杂交分析揭示具有显著不同的基因组异常的肿瘤细胞存在多重亚克隆。该数据表明克隆进展发生在淋巴结内,多个淋巴结亚克隆内一个特定的亚克隆似乎在外周血内。总之,这些报告充分表明他体内的克隆目前发生转化。


反式聚合酶链反应(PCR)检测出无症状携带者体内存在由HTLV-1前病毒HTLV-1感染的T细胞的临近细胞DNA组成的多倍扩增队列,这证明在无症状携带者体内HTLV-1感染的细胞存在多克隆现象。该技术目前广泛应用于表述多种临床环境中克隆的特点。患者克隆稳定性的差异取决于病毒传播的模式。从配偶那里平行传播感染HTLV-1的成人的克隆能力比较复杂,且与那些通过母婴传播感染长期携带病毒的携带者相比,克隆能力的稳定性较差。Linker-mediated(连接介导)PCR更加灵敏,可以检测更大数量的整合前病毒。双倍感染肠类圆线虫的HTLV-1携带者出现HTLV-1感染细胞的寡克隆扩增和高前病毒载量。这些发现是描述性的非定量数据,但是这些技术能提供多种临床条件下HTLV-1感染的细胞的克隆信息。


Bangham及其同事随后利用下一代测序技术开发了新型该通量协议来对前病毒整合位点进行绘图和定量。他们发现在感染HTLV-1的个体的外周血中存在10000至100000克隆体。他们还声称HTLV-1整合到宿主基因组不是随机事件,但是与特殊转录因子结合位点有关,特定原癌基因特殊位点上游与ATL有关。尽管这些新的发现显著加深了对体内HTLV-1感染的T细胞的克隆的了解,但是这些技术在测定从属于特殊克隆的感染细胞数量时效果不佳。为了成功地测量个体克隆内细胞的数量,Bangham等人利用经过裁剪的基因组DNA片段的大小变化,这些片段的变化最多为400种,因为裁剪后修复的DNA片段的大小在300-700碱基对之间。为了克服这种限制,Firouzi等人引入8核苷酸的低聚体标签,这些标签在扩增前标记出经过裁剪的DNA,能够进行超过60000个细胞的分化,显著提高了对个体克隆内细胞数量的定量能力。这些分析的结果为这个假设提供了确实的证据HTLV-1携带者体内存在大量的HTLV-1感染的无限增殖的克隆体,每个克隆体都源于单独的1个感染的T细胞(图5)。从属于特定克隆体的细胞群的大小(即克隆体大小)的变化也非常大,一些克隆体甚至大到足以让传统技术如Southern blot杂交和反式PCR检测为克隆扩增。


不仅如此,最近开发的技术能够描述HTLV-1前病毒整合位点的特点,提供了新的数据集,支持经典逆转录病毒介导肿瘤形成启动子模型的再评估。


体内HTLV-1感染的细胞的鉴别

为了在体内鉴别HTLV-1感染的T细胞,利用多色流式细胞术和荧光介导细胞分类法开发了新技术。CD7表达减少的表达CADM1的CD4细胞代表感染细胞的转化状态,支持转化的细胞与无限增殖但未转化的细胞的分化。这个方法能在无限增殖和转化期间在体内描述HTLV-1感染的T细胞的特点。经过分级的CD4+细胞的表达阵列分析揭示H3K27m3目标基因在无限增殖的HTLV-1感染的T细胞以及转化末端的ATL细胞中被抑制;在后来的细胞中抑制更加强大而广泛(图5)。这些数据为表观遗传学异常是HTLV-1感染T细胞的早期引起白血病的事件之一这个观点提供了证据。目前,利用来自每个片段的细胞的突变分析的研究正在进行,来测定ATL发展期间基因突变的时间。最终这些数将提供HTLV-感染的CD4T细胞无限增殖和转化期间累积的遗传和表观遗传时间顺序特征的深度信息。


最近,已经报告了ATL细胞克隆的分层结构。CD45RA+T记忆干(Tscm)细胞作为层级的顶端有能力重组完全相同的ATL克隆。Tscm细胞可能是ATL细胞克隆演变和集中的地点,可以利用其开发未来的分析靶向疗法。


总结和前瞻


最近ATL研究领域已经取得了显著的进步,随着关于ATL细胞的细胞和分子特征信息的日益增多,人们对ATL的疾病进展也有了更加深入的了解。此外,ATL细胞的“微环境”似乎参与ATL细胞的存活及其对化疗的抵抗作用。一些报告表明正常上皮细胞与间叶细胞之间的相互作用具有重要意义。不仅如此,血管生成和成纤维细胞分泌的骨桥蛋白参与增殖和存活以及在ATL细胞产生的外泌体中发挥可能的作用。在这方面,Notch1信号突变的可能的作用似乎需要进一步研究。希望未来的研究能理解ATL在体内的存活并抵抗化疗和免疫作用的机制。已经报告了将ATL衍生细胞系或主要ATL细胞移植到SCID小鼠身上的异种移植模型,该模型通常用于检验药效。但是,一些问题仍然存在。第一,由于体外感染实验存在技术难题并缺乏适当的HTLV-1感染动物模型,关于T细胞HTLV-1感染无限增殖机制的信息仍然有限。第二,克隆进展期间的分子事件尚未被完全阐明。报告的大部分遗传和表观遗传异常特征都是关于转化末期的ATL细胞,因此转化期间不同阶段的HTLV-1感染的克隆体研究将提供理解克隆增殖和无限增殖机制所需的数据(表6)。第三,个体HTLV-1感染的克隆体累积的遗传学和表观遗传学异常分析对理解克隆进展和恶性转化非常必要。最后,假设前病毒载量是宿主因素决定的主要风险因素之一,则有希望能阐明决定前病毒载量的因素。总之,参与HTLV-1感染自然史的分子过程对HTLV-1相关疾病包括ATL的治疗和预防至关重要。


(参考文献略)

(摘自《Blood》,版权归其所有,仅供内部参考)

编译:张凯

审校:王小茜


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