输血医学中的分子检测

发布时间:2017-05-02       作者:段敏 王治国       来源:临床实验室        浏览:2919       收藏: 0

输血医学检验的重点是检测红细胞(red blood cells,RBC)和/或血小板的细胞膜表达的抗原以及患者血浆中存在的抗RBC或血小板抗原抗体。对这些抗原和抗体的检测至关重要,因为如果某抗原是阳性的血液被输入到具有抗该抗原抗体的患者体内,则患者RBC或血小板系统针对该特异性抗原发生的排斥反应会导致血制品的存活下降、溶血性输血反应、超级溶血反应甚至死亡。


传统上使用血清学试验检测RBC和血小板抗原和抗体。这些试验几乎都是基于血细胞凝集的原理来表明待测血清中存在特定的抗体以及待测RBC或血小板表面存在特定的抗原。例如,正向分型是通过将患者的RBC与已知的抗A、抗B和抗-D抗血清进行反应来检测患者的RBC抗原。任何导致RBC发生凝集的反应都能说明RBC表面具有该特异性抗原(例如,抗A反应中的凝集现象表明RBC膜上存在A抗原)。血清学试验的凝集反应依赖于待测抗体的凝集能力,如ABO血型检测中的IgM类抗体,以及抗人球蛋白抗体、抗C3抗体等抗IgG类二抗。


1. 分子检测的优势

分子检测与大多数输血医学检验应用的传统血清学检测是互补的[1]。分子检测无法代替血清学检测,血清学检测仍然是输血医学检验的支柱。血清学检测的特征很好,足够敏感,可以发现并鉴定大多数临床上重要的同种抗体,对大多数患者情况都是有用的。然而,血清学检测在某些特定患者和情况下具有一定的局限性。这些情况包括:具有混合抗体(热或冷自身抗体、冷凝集素,被动携带母体抗体的新生儿)的患者;携带没有相应检测抗体或抗血清的抗原或抗体的患者(部分或变异抗原、罕见抗原、高发病率抗原);有混合循环RBC或血浆的患者(最近输血、骨髓移植后、血浆置换后);需要确定抗原配型的患者;献血者的大规模筛查。


在上述任何一种情况下,血清学检测的灵敏度和特异性都会受到限制,或者可能在时间、努力或成本方面望而却步。 


鲜为人知的自身抗体或多种同种异型抗体在试验反应中会引起意外的凝集。这会导致无法排除同种异型抗体的可能性,因此使得它很难或不可能确定患者血清中存在的任何临床上有意义的同种异型抗体。由于可用的抗血清和抗原阳性的测试RBC的种类有限,可能无法有效地识别抗低发性抗原的抗体。类似地,由于缺乏市售的抗血清或抗原阴性的红细胞试剂,可能难以确定高发性抗原的抗体。在接受多次RBC输血的患者中,输血的红细胞可能会掩盖患者天然RBCs表面存在或不存在的所感兴趣的抗原。同样地,由于输注血浆的掩盖或稀释作用,接受多次血浆输注或自动血浆置换的患者的血清不能用来自患者的天然免疫系统的抗体进行评估。对于许多RBC或血小板抗原,通常不能通过血清学方法来区分纯合子和杂合子患者的表型。例如,尽管有“剂量”的概念,但是当RBC试剂携带特定表型的纯合子与杂合子时,对于仅具有特定等位基因一个拷贝的红细胞与具有两个拷贝的红细胞,观察到的二者的血细胞凝集强度基本相同。由于可扩展性差,成本高和有限的自动化选择,对RBC或血小板抗原状态的大规模筛查是一项艰巨的任务。因此,每个血液成分单位必须使用劳动力相对密集的技术单独检测每种抗原。


对于以上任何一种情况,分子检测能确定患者或献血员所表达的抗原。对患者表达抗原的测定也可以用于预测患者可以产生哪些同种异型抗体(因为个体只能仅针对其自身缺乏的抗原产生同种异型抗体)。


2. 分子检测的局限性

分子检测在输血医学中的应用也具有一定的局限性。主要是分子检测提供了关于患者基因型的信息,因此不能确定患者血清中任何抗体的特异性。由于分子检测只能确定患者所产生的抗原,因此,只能确定患者理论上可以产生的抗体的抗原特异性。具有未知抗体(或抗体)的患者可以在分子水平进行分型:表达D、C、e和Jk(a),但不表达c、E和Jk(b)。仅基于该信息,患者血清中的抗体可以对抗原c,E,Jk(b)的任何一个或多个或对分子检测无法鉴定的另一种RBC抗原产生特异性反应。这时需要血清学检测来确定患者抗体的特异性。


分子检测是针对人群中普遍存在的预期多态性的频率而发布的。因此,它局限于具有丰富等位基因(例如,ABO血型系统)以及编码基因未知的抗原的基因检测。此外,使用等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)进行的分子检测是基于大小进行确定扩增子,其无法检测点突变、倒置或其他不会改变靶向引物位点或扩增子大小的DNA序列的改变。在这一点上,大多数机构正在批量进行分子检测,因此增加了周转时间,结果导致对于不复杂的患者,分子检测可能比血清学检测还要明显慢很多。最后,如果可行的话,分子检测结果应该使用血清学检测进行确认,因为基因检测以外的遗传决定簇(如启动子)可能影响该抗原的表达。这会导致把实际上没有表达该抗原的患者或者献血者标记为抗原“阳性”[2]。例如,尽管D-阳性个体携带RHCE基因,但用血清学检测其任何RHCE抗原都没有明显的表达。这种表型是由于第6外显子中单个核苷酸(907C)缺失而引起终止密码子提前出现,最终导致RHCE基因的沉默[3]。同样地,依赖顺式或反向取向不同表达的等位基因,也会导致表型和基因型检测方法之间的结果差异。


3.分子技术在输血医学中的应用

目前用于输血医学检测的分子技术都是基于来自患者或献血员DNA序列的扩增。检测的目标是决定红细胞或血小板抗原决定簇产生的基因。这些技术可以辅助血清检测确定捐献的血液产品中细胞膜上表达的抗原或者输血受体的细胞膜上未表达的抗原。这些技术有助于确定受体可能产生针对哪些抗原的抗体,从而预测未来输血可能发生的不相容。输血检验特别适合采用分子方法,因为大多数试验评估的是组成的基因表达(胚系表达),从而可以避免在针对胚系基因背景下的体细胞突变的分子检测中所遇到的灵敏度问题。


目前的检测方法包括各种变换的PCR、限制片段长度多态性(restriction fragment length polymorism, RFLP)、Sanger测序以及高通量多重PCR。最常用的检测方法是具有等位基因特异性引物的PCR和传统凝胶电泳或毛细管电泳检测扩增子,可以使用市售的试剂盒,或者公开的或内部的方案[4,5]。这种方法的缺点是必须为每种待测抗原建立单独的PCR反应体系和单独的检测试验(凝胶或毛细管电泳)。这是一个相对较慢的劳动密集型操作过程。然而,在小批量分子检测的实践中,这些试验在支持技术方面需要相对较低的投资。


使所需劳动力最小化并增加单次试验信息输出的方法之一是多重分子检测,在单次反应中使用多种PCR引物设置用于检测多个等位基因特异性RBC抗原基因。有各种多重方法,每种都使用特定的检测方法报告通过多重PCR产生的等位基因扩增子。目前市场上销售的有三种使用多重PCR的系统,分别是HEA BeadChip系统和LifeCodes RBC(均属于Immucor Inc,Norcross,GA,USA)和BLOODchip(Progenika Inc,Medford,MA,USA)[6-8]。在BeadChip系统中,生成的PCR扩增产物与结合荧光磁珠的等位基因特异性的探针进行杂交。如果序列是匹配的,探针将通过PCR扩增,含荧光的产物增加,从而被检测出。然后通过分析荧光磁珠图案可以确定PCR产物的种类,从而确定患者DNA中对应的基因种类。在BLOODchip系统中,扩增产物被分割成片段并用荧光基团特异性标记。然后将标记的片段和与阵列结合的等位基因特异性DNA探针进行杂交,通过询问产物荧光模式确定每种抗原所存在的扩增片段。LifeCodes系统使用多重RBC抗原等位基因特异性多态性,通过使用荧光捕获磁珠平台进行检测[9]。使用该系统时,可以利用单次多重PCR反应来确定Rh、Kell、Kidd、Duffy、MNS和Dombrock抗原系统的基因型。第二次多重PCR可用于确定Colton、Dombrock、Scianna、Lutheran、Diego、Landsteiner-Wiener(LW)、Cartwright、Knops和Cromer抗原系统的基因型。PCR过后,应将扩增产物与结合寡核苷酸探针的荧光磁珠进行孵育。探针选择性地结合每个抗原等位基因的PCR产物。然后使用流式细胞仪检测DNA结合的磁珠。使用多重PCR反应和单次流式细胞仪可以检测大约25个抗原单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP),与检测每种抗原SNP产物的PCR反应相比,大大增加了分子检测的效率。


由于大多数RBC抗原的等位基因数量有限,所以它们适合采用等位基因特异性PCR进行检测。然而,对于某些遗传变异性较大的基因(如Rh基因),目前可使用DNA测序确定其特异性的遗传变异。尽管下一代测序技术在输血检验中的应用正在研究中,但最常用的还是Sanger测序。Sanger测序是在单向PCR中逐步使用标记的末端核苷酸进行终止,然后使用凝胶或毛细管电泳分析每个PCR产物的长度与终止碱基的位置的关系,从而获得可见的DNA碱基序列。


4. 术语与符号

对于输血医学中分子检测结果的报告,在不同的细节处使用不同的符号策略。另外,分子检测结果可以报告为表型表达或基因型,尽管目前的符号并不能区分表型与基因型。例如,对C698T点突变进行分子检测,其导致Kell基因上的T193M氨基酸被取代,由此产生的抗原通常简称为“K”或“Kell”[10]。如果该检测产生了阳性结果,则该结果可以报告为“K阳性”、“Kell阳性”、“Kell杂合子”、“C698T阳性”、“T193M阳性”等。关于如何报告这种结果,目前还没有广泛接受的标准。对该领域标准化的最近一次尝试是由国际输血学会(International Society of Blood Transfusion)发起的,2011年Storry及其同事参考了这一标准[11]。该学会的完整指南可以在以下网址获取:http://www.isbtweb.org/working-parties/red-cell-Immunogenetics-and-blood-group-terminology/blood-group-terminology/。这些指南为目前RBC抗原的基因型、表型和抗原状态的命名习惯提供了建议,并且为新发现的抗原提供了指导。


5. 红细胞抗原表达

几乎所有已知的血型抗原的分子基础都已经被建立。血型多态性产生于各种遗传机制,包括SNP、单核苷酸缺失、基因缺失、序列重复和基因间重组。大多数抗原都是由SNP造成的。表1列出了最常检测的、具有临床意义的SNP。RHD基因的缺失是Rh阴性表型最常见的分子基础。GYPB的纯合缺失是产生S-s-U-表型的原因。单个核苷酸缺失会导致的读码框移位,进而引入终止密码子,这是ABO血型系统常见的O等位基因和A2等位基因产生的原因。引发无义突变的序列重复是Rh阴性非裔美国人普遍存在不活泼的RHD基因的原因。

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有关红细胞表型的知识,是为已经产生具有临床意义抗体的受体提供相容血液必不可少的,也是红细胞抗体鉴定的重要组成部分。红细胞表型可以通过免疫血液学方法进行检测。然而,这些方法会受到是否能获得可靠抗血清的限制,方法本身具有一定的主观性,并且当患者最近有输血经历或直接抗球蛋白试验阳性时也难以实施。大多数情况下,红细胞表型可以从基因型推断出来,这是一种有价值的辅助手段,也可能成为表型分型的替代方法。表1列出了最常检测的血型基因型。基因分型是高度可靠的并且可以自动化的。然而,对于某些抗原仍然优先选择表型分型,如ABO和Rh(D)等具有多个等位基因的抗原,因为大多数患者中的这些抗原都能使用便宜且容易获得的免疫血液学方法快速检测。


A、B抗原决定簇属于碳水化合物结构,由存在于某些红细胞表面的膜糖蛋白和糖脂构成,是糖基转移酶的作用产物。最常见的ABO等位基因在6个具有外显子6和7的位置不同,结果产生A-转移酶(N-乙酰半乳糖氨基转移酶)、B-转移酶(半乳糖基转移酶)或非功能性产物。然而,迄今为止已经发现并描述了180多个ABO等位基因[12]。此外,A和B转移酶的受体底物是H抗原,其由组织特异性基因FUT1和FUT2编码的转移酶产生。尽管H阴性表型十分罕见,但它负责产生O表型,与ABO基因座的等位基因无关。基于以上原因,ABO基因分型的价值主要是为了解决不正常的ABO血型。


Rh是遗传上最复杂的血型系统。Rh的抗原系统由两个紧密相连的基因RHD和RHCE编码。RHD编码D抗原的许多表位。Rh阴性表型最常见的遗传基础是RHD的缺失和移码突变的存在导致的终止密码子过早出现。保留RHD的基因分型主要是为了解决某些弱表型或部分D表型。


除ABO和D抗原之外,大部分常见的有临床意义的红细胞抗原都是通过SNPs鉴定的(见表1)。MNS抗原存在于血型糖蛋白A和B(GPA和GPB),它们是血型糖蛋白基因家族的两个紧密相连的同源基因GYPA和GYPB的表达产物,分别存在两种不同的等位基因形式[13]。GPA和GPB显示高度的序列同源性。GPA携带MN血型的抗原决定簇,GPB携带Ss血型的抗原决定簇。基因重排是导致GPA和GPB等位基因发生变异的主要机制[14]。某些人群中普遍存在大量的变异等位基因,可能具有重要的临床意义。


Kell系统由25种抗原组成,包括6对对立抗原。每种Kell抗原都是通过编码Kell糖蛋白的KEL基因的单核苷酸点突变确定的。不同种族人群之间Kell抗原发生率存在很大的变异[15]。在红细胞膜上,Kell糖蛋白与携带Kx血型抗原的XK蛋白共价连接。Kell抗原的弱表达可以通过遗传或者后天短暂获得。通过遗传获得的弱表达发生于McLeod表型(不存在XK蛋白)、Leach表型(缺乏血型糖蛋白C的一部分)和一些Gerbich阴性表型(缺乏全部或部分血型糖蛋白C或D)。


Duffy血型系统包括两种常见的对抗抗原和两种高发抗原[15]。Duffy糖蛋白在功能上是重要的,因其具有结合多种趋化因子的能力,称为Duffy抗原趋化因子受体(DARC)。它也是间日疟原虫裂殖子进入红细胞的受体。由于疟疾的选择性压力,Duffy无效表型在某些人群中很常见。在非洲裔美国人群中发现的Fy(a-b-)表型的分子基础是启动子区域(-33 T>C)的一个SNP,其破坏了红细胞上红细胞转录因子GATA-1与合成降低的DARC表达产物的结合位点。由于红细胞启动子只调控红细胞的基因表达,因此内皮细胞的DARC表达正常。到目前为止,所有携带突变的GATA盒的等位基因都已被证明携带FYB,因此Fy(b)在其非甲状腺组织上表达。这就解释了为什么Fy(a-b-)个体可以产生抗-Fy(a)抗体,但不产生抗-Fy(b)抗体。


Kidd血型系统相对简单,具有由一个SNP位点产生的两种对抗性抗原。此外,无效表型不表达高发抗原Jk3。Kidd无效表型来源于两种不同的遗传背景:沉默等位基因的纯合遗传或经遗传获得显性抑制基因In(Jk)与Kidd基因座SLC14A分离[16]。


Diego系统的抗原决定簇由阴离子交换多通道膜糖蛋白带3所携带。Diego血型系统由21个抗原组成,其中两个对抗体Di(a/b)和Wr(a/b)通常是有意义的[17]。Di(b)和Wr(b)是高发性抗原,而其他的Diego系统抗原则属于低发性。Yt血型系统由携带于乙酰胆碱酯酶糖蛋白(ACHE)的SNP编码的两种对抗抗原组成。Yt(b)抗原在美国发生率相对较低,但在以色列人群中很常见。由于ACHE以GPI与红细胞膜相连,所以阵发性夜间血红蛋白血症患者的红细胞缺乏Yt抗原以及Cromer抗原[18]。


Dombrock血型系统由一个对立组Do(a/b)抗原和没有鉴定出有对抗抗原的高发性抗原Hy和Jo构成。虽然抗-Do(a)和抗-Do(b)不常见,但其可能会导致溶血性输血反应。基因分型对于识别相容性供血者至关重要,因为可靠Dombrock抗血清试剂是非常罕见的。


Colton血型系统由水通道蛋白AQP1携带的对立抗原(a/b)和高发性抗原Co3构成。Co3的缺失导致无表型Co(a-b-),其仅在罕见的个体被发现。


LW血型系统由细胞内粘附分子ICAM-4携带的对立抗原LW(a/b)构成。LW抗原的表达受Rh蛋白存在与否的强烈影响,因此抗-Lw(a)抗体容易与抗-D抗体相混淆。基因分型有助于对于正确区分此类抗体。


Cromer血型系统由补体调节蛋白衰变加速因子CD55携带的12种高发和3种低发抗原构成[19]。Cr(a-)表型主要存在于非洲裔美国人群中,但仍然很少见。Cr(a)的对立抗原尚未发现。罕见的Cromer无效表型,又可称为Inab表型,与红细胞缺乏CD55有关。与阵发性夜间血红蛋白尿患者相反,Inab红细胞对补体介导的细胞裂解具有抵抗性。Inab表型的分子基础是SNP或引入替代剪接位点,结果导致过早地出现终止密码子。


Knops血型系统包含由补体受体1(CR1)携带的8种抗原[20]。在白种人群中,McC(b)和S1(a)是低发生率,但在非裔美国人群中却很常见。抗Knops抗体的临床意义不大,但在预输注测试中经常遇到所谓的高滴度、低亲合力抗体(HTLA)。通过连续稀释HTLA通常可观察到血细胞凝集现象,当怀疑存在具有重要临床意义的抗体时,该现象会使免疫血液学的检查变得更加复杂。在这种情况下,基因分型是辅助鉴定和排除有重要临床特异性抗体的有效手段。


6. 血小板抗原表达

血小板携带对于输血医学有重要意义的抗原,包括ABO抗原、人白细胞抗原(HLA)I类和血小板特异性抗原。对于表达仅限于血小板的抗原的研究必须与RBC抗原分开进行,其被分类到人血小板抗原(HPA)命名系统(见表2)[21]。迄今为止,已经在分子水平确定了33种HPA。已经确定出六对双等位基因HPA对(HPA-1a/1b,-2a/2b,-3a/3b,-4a/4b,-5a/5b,-15a/15b),其中出现频率较高的等位基因用小写字母“a”表示,相应等位基因的血清学未确定出来的抗原用“w”表示。


通过表型鉴定血小板抗原比红细胞表型更加困难。最常用的方法是流式细胞术,但需要专门的仪器。另外,高质量的抗血清难以获得。含有血小板抗体的大多数人血清中也含有HLA I类抗体。抗低频抗原的抗血清非常罕见。基于以上原因,基因分型取代了血清学表型分析,成为检测HPA的主要手段。


多种分子检测方法可用于HPA基因分型。因为几乎所有的HPA都是由单碱基取代产生的,HPA基因分型最常用的方法是使用寡核苷酸序列特异性的引物进行PCR DNA扩增(PCR-SSP)。必须针对每个特定的引物组优化扩增条件。通常使用PCR-SSP,因为它的程序相对简单、便宜;然而,它需要PCR后续处理步骤。熔解曲线分析是HPA基因分型的另一种常用方法。在这种技术中,使用侧翼引物对包含感兴趣的血小板SNP的DNA进行PCR扩增。使用两种不同的荧光标记的寡核苷酸探针与患者SNP附近相邻的DNA序列结合进行产物的检测。通过荧光能量转移(FRET)检测两个探针的结合结果。仪器在不断增加的温度下读取一系列数据,探针在不同温度下解离或“熔化”,产生熔解曲线,曲线的形状取决于所感兴趣的SNP存在与否。第三种方法是50-核酸酶试验或TaqMan实时定量PCR试验(RT-PCR)。该方法使用两个序列特异、5’端被含有不同报告基因的荧光标记、3’端连接猝灭剂分子的单链DNA探针(TaqMan探针)。探针被设计成可以结合于DNA模板上感兴趣的血小板SNP。当结合非常接近猝灭剂基团时,报告基因的荧光通过FRET降低。用于大规模筛查的实际基因分型,如献血者或NAIT筛查,需要高通量的检测方法。目前已经描述了采用玻片载玻片微阵列、微板阵列和液珠阵列的多个基于PCR的高通量系统[22-25]。

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血小板抗原检测最常见的临床情况是应用于胎儿和新生儿同种异体免疫性血小板减少症(FNAIT)和输血后紫癜(PTP)。不常见的用途包括评估血小板输注不应性、免疫性血小板减少症(ITP)和药物诱导的免疫性血小板减少症。在FNAIT发生过程中,针对血小板抗原的母体IgG同种抗体穿过胎盘导致胎儿发生免疫反应,随后出现新生儿血小板减少症。母亲所涉及血小板抗原为阴性的鉴定说明有妊娠风险;但它并不一定表明怀孕受到了影响。父亲所涉及抗原是纯合的或者胎儿是阳性的鉴定,表明妊娠具有高风险。PTP是罕见的输血并发症,其中血小板抗原的同种异体免疫与严重血小板减少症的时间相符。患者对所涉及血小板抗原为阴性的鉴定能够进一步确诊。以上两种应用,与表型鉴定相比,基因分型的明显优势是不需要血小板,可以直接利用从外周血、口腔拭子或羊水获得的体细胞DNA进行检测。血小板抗原检测在多传染性血小板难治性患者的管理中具有一定的局限性,因为这种情况下针对HPA的抗体很罕见,即使产生,也通常与HLA抗体结合[26]。在ITP和药物诱导的免疫血小板减少症中,对抗体的鉴定几乎不需要进行HPA分型。


7. 细胞游离核酸检测

在过去的十年中,血清、血浆、尿液及其他体液的细胞游离核酸检测的发现促进了蛋白质编码基因的研究,可以作为一种潜在灵敏度更高的检测疾病的手段。通常情况下,组织中DNA的分离是采用苯酚氯仿提取、乙醇沉淀的标准程序。然而,DNA也可以直接通过离心从血清、血浆或其他体液中获得,首先分离出细胞和血小板,随后使用扩增方法如RT-PCR或其他检测方法进行后续分离[27]。细胞游离核酸检测也适用于输血医学[28]。已有关于采用在不同孕期怀孕孕妇母体血浆样本进行胎儿RHD研究的报道[29-31]。Brojer及其同事的研究[29]发现,在进行一组RT-PCR后,母体血浆确信可以用作检测胎儿RHD基因分型(99.6%预测值)的样品来源,可以理解的是额外的多态性的实现可以将预测值提高到100%。最近对其他血型同种抗原(D、c、E和Kell)的无创基因分型的研究也有报道[32]。对于FNAIT,胎儿血小板抗原的基因分型也可以采用从母体血浆中提取的胎儿游离DNA进行检测[33,34]。


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